吡唑-磺酰胺杂合体的探索：合成、分子建模、潜在抗菌活性、DHFR抑制及药代动力学特征

《Chemical Biology & Drug Design》：Exploration of Pyrazole-Sulfonamide Hybrids: Synthesis, Molecular Modeling, Potential Antimicrobial, DHFR Inhibitor, and Pharmacokinetic Profile

　　

摘要 通过将N-(4-(肼羰基)芳基)苯磺酰胺与乙酰丙酮、乙酰乙酸乙酯和/或2-(乙氧基亚甲基)丙二腈反应，合成了新型吡唑基磺酰胺缀合物5、6和7。对所构建衍生物的密度泛函理论（DFT）计算显示出相似的弯曲构型。缀合物5a-b和6a-b呈现平行的HOMO-LUMO结构，而硝基衍生物5c和6c则表现出其前线分子轨道（FMOs）的交替构型。此外，研究评估了其对不同细菌和真菌病原体的抗菌活性。吡唑衍生物5c、6b、7a和7c对金黄色葡萄球菌（S. aureus）（最小抑菌浓度（MIC）= 3.125–6.25 μg/mL）和大肠杆菌（E. coli）（MIC = 3.125 μg/mL）表现出高活性，超过了标准抗生素的活性，其中6b对细菌和真菌均表现出最广谱的活性。研究人员检测了所研究磺酰胺的体外二氢叶酸还原酶（DHFR）抑制效果，并与甲氨蝶呤进行了比较。在筛选的衍生物中，杂合体7a-c表现出更有效的抑制活性，从而确定了取代模式对活性的影响。此外，研究人员还针对二氢叶酸还原酶（DHFR）酶（PDB: 3TZF）对所制备的类似物进行了分子对接研究，其中杂合体6a表现出最高的结合活性，结合评分（S = ?6.5129 kcal/mol），优于甲氨蝶呤（S = ?6.4743 kcal/mol）。此外，研究人员使用SwissADME模拟了药代动力学特征，以评估类药性和潜在的口服生物利用度。所有杂合体均表现出在可接受的类药性限度内的有益理化性质，证实了吡唑-磺酰胺骨架作为未来具有良好药代动力学潜力的口服活性候选药物的优化靶点。

吡唑-磺酰胺杂合体研究论文解读

一、研究背景与意义

抗菌药物耐药性（AMR）的持续出现已成为现代医学和全球公共卫生面临的最重大威胁之一。现有抗生素疗效的减弱，尤其是针对多重耐药（MDR）革兰氏阴性和阳性微生物，凸显了开发具有新作用机制的创新化疗药物的迫切需求。这一需求推动了抗菌药物发现从经典骨架向分子杂合体合理构建的范式转变。分子杂合策略旨在将不同生物活性基序的药效团协同结合到单一化学实体中，以最大限度地提高效力、克服耐药机制并优化整体药理学特征。在此背景下，将具有良好成药性的杂环模板与已确立的药效团进行分子杂交已成为一个高回报的研究领域。

吡唑核心作为一种五元芳香杂环，是药物化学的基石；而磺酰胺药效团（-SO₂NH-）则是化疗史上历史最悠久、成就最卓著的药效团之一，其历史可追溯至百浪多息（Prontosil）的发现。磺胺类药物及其生物电子等排体通过竞争性抑制二氢蝶酸合酶（DHPS）而发挥抗代谢物作用，这是微生物叶酸生物合成途径中的一个关键酶。这种抑制会耗尽四氢叶酸（THF）池，而THF是胸苷和嘌呤生物合成所必需的辅因子，最终导致抑菌作用。然而，由于突变型DHPS或外排增强导致的磺胺耐药性限制了其作为单一疗法的应用。尽管如此，其已验证的靶点和较高的配体效率使其成为杂合分子设计的重要构建模块。将磺酰胺与吡唑杂环结合以产生新型吡唑-磺酰胺杂合体，是重振磺胺类药物并克服耐药性的一个有前景的策略。该策略旨在开发具有双重多靶点抑制作用的药物，尽可能同时干扰叶酸途径中的DHPS和另一个关键酶——二氢叶酸还原酶（DHFR）。这种同步抑制将产生协同抗菌作用，显著降低耐药性发展的可能性。此外，吡唑环独特的电子和空间效应可调节磺酰胺质子的酸性，从而改善与靶酶的亲和力，同时其亲脂性可被合理调节以最大化膜渗透性。本研究旨在探索吡唑-磺酰胺作为抗菌剂的活性，并通过分子建模、对接和模拟评估其与DHFR的相互作用，同时通过药代动力学和ADME/T建模评估其治疗效力和类药性。

二、主要关键技术方法

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：利用密度泛函理论（DFT）在B3LYP/6-311++G(d,p)水平上进行分子建模，以检查所考虑衍生物的三维形状、前线分子轨道（FMOs）和电子特征；通过测定最小抑菌浓度（MIC）和抑菌圈（IZ）评估抗菌效力，测试菌株包括革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（S. aureus ATCC 25923）、革兰氏阴性菌大肠杆菌（E. coli ATCC 35218）以及真菌白色念珠菌（C. albicans ATCC 10231），并与氯霉素、头孢噻吩和放线菌酮等标准药物对比；采用分光光度酶抑制试验评估对二氢叶酸还原酶（DHFR）的抑制效果，并与甲氨蝶呤比较；使用分子操作环境（MOE 2019.0102）软件针对鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）的二氢蝶酸合酶（DHPS，PDB ID: 3TZF）进行分子对接研究；最后，使用SwissADME模拟药代动力学特征以评估类药性和潜在口服生物利用度。

三、研究结果

3.1 吡唑-磺酰胺杂合体5a-c、6a-c和7a-c的合成

研究人员首先将4-氨基苯甲酸乙酯（2）与取代的芳基磺酰氯（1a-c）反应，得到相应的4-(芳基磺酰胺基)苯甲酸乙酯衍生物（3a-c）。随后，通过与水合肼在乙醇中加热，将中间体转化为N-(4-(肼羰基)苯基)-取代苯磺酰胺化合物（4a-c）。这些酰肼产物是组装三种不同吡唑分子框架的关键中间体。第一类缀合物5a-c通过酰肼-磺酰胺化合物4a-c与乙酰丙酮在沸腾乙醇中反应获得，产率分别为82.6%、75.8%和80.1%。第二类杂合体6a-c通过各酰肼-磺酰胺化合物与乙酰乙酸乙酯在乙醇中回流反应4小时合成。最后一类杂合体7a-c通过酰肼-磺酰胺化合物与2-(乙氧基亚甲基)丙二腈在含哌啶的热乙醇/DMF混合物中反应获得，产率分别为70.2%、64.3%和72.5%。所有化合物的结构均通过红外光谱（IR）、核磁共振（NMR）和质谱（MS）等波谱分析以及元素分析确证。该策略提供了一种经济高效且模块化的方法，可将磺酰胺部分的药效团与三种不同的吡唑型结构连接起来。

3.2 DFT计算

DFT计算表明，所研究的化合物具有相似的优化结构，甲氧基、氯和硝基取代基与其所连接的苯环共面，而磺酰胺的氧和氮原子偏离苯磺酰胺环的平面。前线分子轨道（FMOs）分析显示，类似物5a-b和6a-b的HOMO-LUMO结构相似，而硝基类似物5c和6c表现出FMOs的交替构型。类似物7a-c的HOMO定域在氨基氰基吡唑核上，而LUMO则延伸至整个框架。所研究杂合体的HOMO能量（E_H）范围为?6.62至?7.13 eV，LUMO能量（E_L）范围为?1.99至?3.60 eV。能隙（ΔE_H-L）在3.19–4.77 eV范围内，顺序为：7c < 6c < 5c < 7b < 7a < 5a < 6a < 5b < 6b，表明硝基类似物（c）的能隙小于甲氧基（a）和氯（b）类似物。FMOs能量还被用于估算电负性、硬度、亲电性等化学反应性参数。Mulliken原子电荷分析显示，磺酰硫原子带正电（~0.765），而连接的氧原子带等量负电（~ ?0.583），反映了磺酰基的强吸电子特性。化合物7a-c表现出最强的电荷重新分布，其中氰基增强了吸电子效应，氨基增强了给电子效应，从而实现了更有效的分子内电荷转移（ICT）。偶极矩（μ）从3.33 D（5c）到8.00 D（6a）不等，表明后者电荷分离增强。所有研究的缀合物均表现出优于尿素的超极化率，为尿素的4.73–10.43倍。

3.3 抗菌测定

抗菌测定证实吡唑-磺酰胺杂合体具有广谱活性。杂合体5c、6b、7a和7c对金黄色葡萄球菌（S. aureus）的MIC值为3.125–6.25 μg/mL，与对照药物氯霉素和头孢噻吩（MIC = 6.25 μg/mL）相当或更优。对于大肠杆菌（E. coli），杂合体5c、6b和7a表现出MIC = 3.125 μg/mL，效力高于参考抗生素（MIC = 6.25 μg/mL）。杂合体6b表现出显著的广谱活性，对两种细菌菌株的MIC均为3.125 μg/mL，对白色念珠菌（C. albicans）的MIC为12.5 μg/mL，且具有最大的真菌抑制圈（47 mm），优于放线菌酮（6.25 μg/mL，33 mm）。杂合体5a和5b则表现出弱至中等的活性（MIC 25–50 μg/mL）。结果表明，磺酰胺的取代模式对增强广谱效力起着至关重要的作用。

3.4 DHFR抑制测定

对DHFR的体外抑制测定显示，含有二甲基吡唑部分的磺酰胺杂合体5a-c中，5a表现出中等活性（IC₅₀ = 2.66 ± 0.07 μM），引入氯取代基的5b活性增强（IC₅₀ = 2.03 ± 0.11 μM），而含硝基的5c活性最高（IC₅₀ = 1.88 ± 0.39 μM），但略低于甲氨蝶呤（1.19 ± 0.30 μM）。含有吡唑啉酮部分的杂合体6a-c活性显著下降，其中6b效力最弱（IC₅₀ = 3.84 ± 0.50 μM），表明吡唑啉酮部分的引入可能产生空间位阻或破坏平面性。含有氨基吡唑部分的杂合体7a-c表现出最有前景的抑制活性，7a（1.46 ± 0.18 μM）、7b（1.79 ± 0.06 μM）和7c（1.37 ± 0.33 μM）均接近甲氨蝶呤的活性。三种吡唑模板的DHFR抑制趋势为：7a-c（氨基-氰基吡唑）> 5a-c（二甲基吡唑）> 6a-c（吡唑啉酮），表明吡唑模板上氢键供体官能团（氨基/腈基）的存在对DHFR抑制活性比磺酰胺芳基的吸电子性质更重要。此外，多元线性回归（MLR）分析显示，DFT计算参数与抗菌活性（R² = 0.9163–0.9373）和DHFR抑制活性（R² = 0.9383）具有良好的相关性。

3.5 分子对接研究

分子对接研究揭示了杂合体在DHFR酶活性位点内的结合特征。含有二甲基吡唑部分的杂合体5a-c中，5b表现出较优的结合评分（S = ?5.8069 kcal/mol），其磺酰胺官能团的O 39原子与Lys146形成氢键受体相互作用。含有吡唑啉酮部分的杂合体6a-c中，6a表现出最佳结合评分（S = ?6.5129 kcal/mol），甚至优于甲氨蝶呤（S = ?6.4743 kcal/mol），其磺酰胺部分的O 24原子与Thr62相互作用，酰胺基团的O 33原子与Ser222相互作用，苯胺环与Lys221通过π–H键结合。含有氨基吡唑部分的杂合体7a-c中，7c表现出最佳对接评分之一（S = ?5.9413 kcal/mol），其腈基的N 29原子与Thr4形成单一氢键。值得注意的是，对接排名（6a > 7c ≈ 7a > 7b）与酶IC₅₀排名（7c > 7a > 7b > 6a）不完全一致，这可能归因于刚性对接模型仅考虑结合口袋的互补性，而体外实验还考虑了溶剂化和构象熵的影响。

3.6 药代动力学性质

SwissADME分析显示，所有杂合体均表现出合理的理化性质。杂合体5a、6a和7a表现出最均衡的特征，具有良好的GI吸收、低BBB渗透性（7a除外，其BBB渗透性高）和完全的Lipinski规则符合性。硝基衍生物5c和6c因高极性出现一次Lipinski违规，但仍表现出合理的GI吸收和低BBB渗透性。所有杂合体均表现出相似的溶解度特征、良好的类药性评分和无非Pgp介导的外排风险，表明其具有足够口服生物利用度的潜力。

四、讨论与结论总结

综合所有DFT、抗菌、DHFR抑制和对接研究结果，可以得出以下结论：(i) 吸电子芳基（硝基、氯）可提高抗菌效力并增加DFT预测的反应性（更低的HOMO-LUMO能隙）；(ii) 杂合体7a-c中的氨基-氰基吡唑是DHFR的最佳药效团；(iii) 尽管杂合体6a-c中的吡唑啉酮部分酶IC₅₀值较低，但为杂合体6a提供了最佳对接位置，表明该化合物存在第二种结合模式。综合各单项测定结果，杂合体6b、7a和7c是最有前景的先导化合物。

研究人员合成了九个新型的多种取代吡唑基磺酰胺化合物5、6和7，并通过波谱分析确定了其化学结构。抗菌活性研究表明，6b、6c、7a和7c对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）具有强效和广谱的抗菌特性，其效力通常优于典型参考药物。杂合体6b对所有受试微生物的突出效力表明其是进一步优化为抗菌先导物的良好候选者。杂合体7a-c表现出强效的DHFR抑制活性，几乎与标准药物甲氨蝶呤相当，是开发新型DHFR抑制剂的最有希望的候选者。对接研究显示杂合体6a结合最佳，甚至优于参考药物甲氨蝶呤。SwissADME药代动力学分析证实所有杂合体均表现出合理的GI吸收、无非Pgp底物行为、可靠的生物利用度评分（= 0.55）并符合Lipinski五规则。这些结果证实吡唑-磺酰胺骨架具有作为口服生物可利用药物进一步优化的前景。未来工作将解决当前数据库中的两个空白：通过酶动力学研究（Lineweaver-Burk法）验证杂合体7a-c是否基于其对接位置对DHFR酶表现出竞争性抑制活性，以及在非致病性哺乳动物细胞系上进行细胞毒性筛选以确定先导杂合体6b、7a和7c的选择性指数。