超快魔角旋转与氘代技术实现完整真菌细胞壁高分辨质子检测固态核磁共振

《ChemBioChem》：Ultrafast MAS and Deuteration for High-Resolution Proton Detected Solid-State NMR of Intact Fungal Cell Walls

　　

糖类是真菌细胞壁的主要成分，并在真菌致病机制中发挥核心作用，因此对这些生物聚合物进行原子级别的结构与动态洞察对于开发新型抗真菌疗法至关重要。基于快速魔角旋转（MAS）的1H检测固态核磁共振（ssNMR）为在完整真菌细胞壁中以原子分辨率位点特异性研究糖类提供了前所未有的机遇。然而，ssNMR中的1H分辨率和灵敏度在详细研究中常常受限，尤其是对于像完整真菌细胞这样刚性且高度异质的样品。在本研究中，研究人员针对人类病原性白色念珠菌（Candida albicans）真菌糖类的刚性核心，在60至150 kHz MAS速率和部分真菌细胞壁氘代方案下，对1H线宽和1H T′2相干时间进行了详细研究。研究人员展示了用于刚性细胞壁糖类的多维1H/13C化学位移归属实验的可能性与局限性。此外，研究人员利用弛豫测量探测了动力学，从而能够获取从纳秒到微秒尺度的运动信息。总体而言，研究人员展示了1H检测ssNMR光谱学的重大方法学进展，在完整真菌细胞壁中实现了前所未有的刚性糖类1H分辨率。这些发展可适用于其他人类病原体中完整细胞壁的ssNMR详细研究。

研究背景与科学问题

真菌感染对人类健康构成严重威胁，其中由曲霉属、念珠菌属、隐球菌属等引起的侵袭性真菌感染尤其危险，特别是对免疫受损人群。近年来，由于抗真菌耐药性的演变，感染病例和相关死亡人数持续上升。真菌细胞壁在保护真菌免受环境胁迫、调控生命周期等方面起着关键作用，因此成为抗真菌药物研发的重要靶点。对完整真菌细胞壁进行原子层面的结构研究，对于开发新的治疗药物、诊断工具以及深入理解真菌致病机制至关重要。

以往对细胞壁多糖结构的研究主要依赖质谱、气相色谱和液态核磁共振等方法，但这些技术通常需要在剧烈化学或生物学条件下溶解细胞壁，这会破坏其化学成分和细胞完整性，导致结果不一致。近年来，魔角旋转（MAS）固态核磁共振（ssNMR）作为一种非破坏性技术被用于分析完整真菌细胞壁的分子架构、水合状态、动力学及药物相互作用。然而，此前大多数研究采用¹³C检测，虽然能获得较好谱图，但所需样品量大，限制了其广泛应用。随着探针技术进步，更小直径转子可实现更高MAS频率，同时减少样品需求量。直接检测高旋磁比核——¹H，有望补偿因样品量减少导致的信噪比损失。然而，对于刚性多糖，¹H线宽通常远大于蛋白质，这主要源于完整细胞样品的结构高度不均一性。尽管已有少数研究尝试将¹H检测应用于细菌、真菌和植物的细胞壁，但对完整细胞中刚性多糖的¹H线宽随MAS频率变化、弛豫行为、归属可靠性、动力学以及部分氘代影响等问题，仍缺乏系统性和定量评估。填补这些空白对于建立广泛适用的¹H检测ssNMR方法来研究完整细胞中的多糖至关重要。

研究内容与意义

本研究以人类病原性白色念珠菌（Candida albicans）为模型，系统探索了MAS频率和氘代程度对其细胞壁刚性核心组分β-1,3-葡聚糖的¹H线宽和相干寿命的影响。研究表明，提高MAS频率和实施细胞壁氘代均可显著减小¹H线宽并延长¹H T′₂弛豫时间。此外，研究人员还展示了利用多维质子检测谱进行化学位移归属的可能性与局限，并通过弛豫测量揭示了刚性多糖在纳秒至微秒尺度上的动态特性。这项工作建立了适用于完整真菌细胞壁的高分辨¹H检测ssNMR工作流程，为其他结构更复杂的真菌细胞壁研究奠定了基础。

关键技术方法

研究人员采用了多种关键固态核磁共振技术：首先，利用交叉极化（CP）结合¹H检测的二维hCH实验，在不同MAS频率（60–150 kHz）下采集谱图，分析¹H线宽和¹H T′₂相干时间。其次，采用三维hCCH TOCSY实验进行¹³C和¹H化学位移归属。第三，利用¹³C R₁和R₁ρ弛豫测量探测多糖的纳秒至微秒尺度动力学。第四，通过制备两种氘代样品——反向分数氘代（iFD）样品和使用含50% D₂O培养基培养的50% DCN样品，并结合²H固态核磁共振和ATR-FTIR光谱验证氘掺入情况，研究部分氘代对¹H线宽的影响。

研究结果

2.1 样品制备

研究人员改进了液体YPD培养方案，在10 mL液体培养基中培养白色念珠菌酵母细胞，仅需100 mg ¹³C D-葡萄糖和100 mg ¹⁵N氯化铵，最终从10 mL培养基中获得约5 mg标记细胞。扫描电子显微镜（SEM）背散射电子成像显示细胞呈酵母样形态。

2.2 完全质子化白色念珠菌的¹H线宽

在60 kHz MAS下，β-1,3-葡聚糖的平均¹H线宽为652 ± 155 Hz，均匀展宽贡献为453 ± 1 Hz。当MAS频率升至150 kHz时，¹H T′₂相干时间近线性增加，总¹H线宽降至353 ± 60 Hz，均匀贡献降至203 ± 60 Hz，线宽缩减约55%。不均匀贡献为63 ± 9 Hz。H6/H6′位点因较高流动性而呈现更窄线宽。对于高动态组分，INEPT hCH实验在150 kHz MAS下未观察到增益。

2.3 化学位移归属

利用二维CP hCH和三维hCCH TOCSY实验，研究人员成功完成了β-1,3-葡聚糖所有¹H和¹³C化学位移的归属。通过识别端基异构C1位移（103.4 ppm，对应β-异构体）起始，沿碳链追踪相邻碳关联，确定了各共振信号。与传统的¹³C检测DARR谱比较，两者表现出相似的指纹特征。三维HcCH TOCSY实验中的¹H–¹H相关性在已知¹³C位移后有助于进一步确认归属，但由于H2–H6位点化学位移分散度有限，仍需更高场强或更快MAS来提高分辨率。

2.4 多糖动力学

在150 kHz MAS下，通过位点特异性¹³C R₁和R₁ρ弛豫测量发现，环内C1–C5位点的R₁值范围狭窄（0.18–0.28 s^?1），R₁ρ值范围为18.4–21.3 s^?1，表明吡喃糖环碳在纳秒和微秒时间尺度上具有可比拟的运动幅度。C6位点则表现出显著增强的流动性，其R₁和R₁ρ速率分别约为C1–C5位点的四倍和两倍，归因于–CH₂OH基团的快速取向重排。探测器分析揭示C1–C6位点在近纳秒和近微秒尺度均有运动，而较慢运动（探测器ρ₀）仅在C2–C5位点观测到，表明这些位点存在微秒尺度的集体运动。

2.5 氘掺入

研究人员制备了两种氘代样品：iFD样品（使用²H,¹³C标记的D-葡萄糖）和50% DCN样品（在含50% D₂O的YPD培养基中使用²H,¹³C D-葡萄糖）。两种样品的生长曲线与质子化样品无显著差异。²H ssNMR谱证实了氘掺入细胞壁基质形成C─D或C─O─D键，测得iFD样品的平均四极耦合常数C_Q = 89 ± 2 kHz，小于纯²H,¹³C D-葡萄糖粉末的值，表明细胞壁内多糖具有更高的流动性。ATR-FTIR光谱在~2300 cm^?1处检测到C─D伸缩峰，进一步确认了氘掺入。

2.6 氘代白色念珠菌的¹H线宽

在60 kHz MAS下，iFD样品的总¹H线宽为335 ± 65 Hz，50% DCN样品为208 ± 34 Hz，均显著低于完全质子化样品（652 ± 155 Hz）。iFD样品中H6和H6′质子甚至在60 kHz MAS下即可分辨。在150 kHz MAS下，50% DCN样品的¹H线宽进一步降至126 ± 34 Hz，均匀贡献为64 Hz，不均匀贡献为69 ± 14 Hz，仍占主导。将完全质子化样品在D₂O中孵育3天后，¹H线宽略有改善，且水信号得到抑制。氘代导致¹H信号强度下降约3.5倍，但因线宽显著变窄，氘代样品可使用更大体积转子在较低MAS频率下获得足够信噪比。

总结与讨论

本研究表明，将MAS频率提升至150 kHz可线性降低β-1,3-葡聚糖的¹H线宽并延长¹H T′₂相干寿命，使刚性细胞壁多糖的¹H线宽达到与蛋白质ssNMR相当的水平。二维CP hCH与三维hCCH TOCSY实验的组合足以完成β-1,3-葡聚糖的完整¹H和¹³C化学位移归属，与传统¹³C检测方法相比具有相似的谱图指纹特征。位点特异性¹³C弛豫测量揭示了环内C1–C5位点在纳秒和微秒尺度上具有可比的动力学特征，而C6位点因–CH₂–OH基团的快速取向重排表现出增强的流动性。真菌细胞氘代是一种在不扰动细胞天然结构组织的前提下有效改善¹H线宽的技术，但会降低整体灵敏度。超过150 kHz的MAS频率将使完全质子化样品受益，而部分氘代对于较低MAS频率下的¹H检测ssNMR研究是必要的。样品在D₂O中孵育可适度改善线宽并抑制水信号。总体而言，本研究建立的用于完整白色念珠菌刚性细胞壁化学位移归属和动力学研究的¹H检测ssNMR工作流程应可直接转移至其他结构更复杂的真菌物种。结合近期涌现的超高场核磁共振波谱仪和更快MAS技术，将进一步推动高分辨¹H检测ssNMR在更广泛的完整细胞样品中的应用。