洋葱（Allium cepa L.）提取物通过槲皮素糖苷衍生物调控乙型肝炎病毒相关炎症通路的实验与药物信息学研究

《Chemistry & Biodiversity》：Experimental and Pharmacoinformatic Studies Reveal Allium cepa L. Extract-Mediated Modulation of Hepatitis B Virus Associated Inflammatory Pathways via Quercetin Glucoside Derivatives

　　

摘要专业翻译 乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染仍是全球重大健康负担，常进展为慢性肝脏炎症、纤维化和肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）。尽管现有抗病毒疗法能有效抑制病毒复制，但其调节HBV相关并发症的能力仍然有限。本研究采用体外与计算相结合的方法，探讨洋葱（Allium cepa，AC）鳞茎甲醇提取物在HBV相关抗病毒及宿主调节方面的潜力。研究人员利用表达HBV的HepG2.2.15细胞，评估了细胞毒性、逆转录酶（Reverse transcriptase，RT）抑制、HBsAg与HBeAg水平的时间及剂量依赖性抑制、炎性细胞因子以及与HBV感染相关的特定宿主基因表达。通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）检测到的植物化合物，研究人员利用Schr?dinger软件套件对其与TLR4的相互作用进行了分子对接和分子动力学模拟。AC处理使HBsAg和HBeAg水平分别降低高达61.0%和75.37%。与丙酚替诺福韦（Tenofovir alafenamide，TAF）联合处理后，抑制作用分别增强至79.0%和94.55%，且未影响细胞活力。在LC-MS鉴定的植物化合物中，计算分析显示槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷（Quercetin 3,4'-diglucoside）与TLR4的相互作用最为稳定，具有最高的结合亲和力（?14.23 kcal/mol），并在100 ns模拟过程中保持稳定。总体而言，AC通过预测的TLR4介导通路调节以及减少HBV抗原分泌，减轻了HBV诱导的炎症，支持其作为慢性HBV感染管理补充治疗候选药物的潜力。

论文解读

一、研究背景与意义

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染是全球性的重大公共卫生问题，影响着约2.54亿人，每年导致近110万人死于肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）等进展性肝脏疾病。HBV是一种小型、有包膜、部分双链DNA病毒，属于Hepadnaviridae家族，可分为A至J十个基因型。目前，核苷（酸）类似物（Nucleos(t)ide analogs，NAs）如丙酚替诺福韦（Tenofovir alafenamide，TAF）虽能显著抑制病毒复制并降低HCC风险，但由于共价闭合环状DNA（cccDNA）的持续存在和抗病毒免疫受损，难以实现功能性治愈。此外，长期用药可能产生耐药性和副作用。HBV的持续感染常伴随低度炎症和免疫调节紊乱，而现有的抗病毒药物对宿主炎症通路的调节能力有限。HBV的结构和调节蛋白，如HBsAg、HBcAg、HBeAg和HBx，在免疫逃逸和疾病慢性化中发挥关键作用，可抑制先天性和适应性免疫信号，导致T细胞功能障碍和免疫耗竭，间接促进炎症和纤维化反应。因此，亟需开发针对宿主炎症通路的补充治疗策略。植物来源的化合物因其多靶点活性，在调节宿主-病毒相互作用、调控氧化应激、免疫信号和纤维化通路方面具有潜在优势，可能补充现有抗病毒疗法。研究人员前期研究已表明洋葱（Allium cepa，AC）和牡荆（Vitex negundo）提取物可通过抑制黄嘌呤氧化酶，减轻替诺福韦酯（TDF）诱导的肾毒性，但它们在HBV相关炎症信号中的作用尚不明确。基于此，本研究旨在通过体外实验与计算模拟相结合的方法，探讨AC甲醇提取物对HBV相关抗原抑制和炎症调节的潜力及其分子机制。

二、主要技术方法

研究人员采用了整合的体外药理学和计算生物学方法。体外实验方面，使用HBV稳定复制的HepG2.2.15细胞系（来源于ICGEB，印度新德里）和人单核细胞系THP-1（来源于NCCS，印度浦那）进行共培养模拟炎症微环境。主要方法包括MTT法评估细胞毒性、ELISA法检测HBsAg、HBeAg、HBcAg和IL-6水平、qRT-PCR分析宿主炎症、氧化应激和纤维化相关基因表达、荧光法测定逆转录酶（RT）抑制活性、Folin-Ciocalteu和氯化铝比色法测定总酚和总黄酮含量、LC-MS进行植物化学成分分析。计算研究方面，从IMPPAT 2.0和PubChem数据库获取洋葱植物化合物，通过Molsoft平台评估药物相似性，ADVERPred预测毒性，SuperPred预测靶点，STRING构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络并进行KEGG通路富集分析，Cytoscape可视化网络。分子对接采用Schr?dinger套件2025-3的Glide模块（超精度模式），以TLR4-MD2复合物晶体结构（PDB ID: 3FXI）为靶点，MD2-TLR4-IN-1为参考抑制剂。分子动力学（MD）模拟采用Desmond模块，在OPLS4力场下进行100 ns模拟。

三、研究结果

3.1 体外药理学结果

3.1.1 细胞毒性评价： AC在HepG2.2.15细胞中的半数抑制浓度（CC₅₀）为561.95 μg/mL，TAF为165.42 μM。AC在250 μg/mL时细胞活力降至69.21%，500 μg/mL时降至57.88%；TAF在100 μM时活力降至61.08%，表明两者在高浓度下均降低细胞活力。

3.1.2 HBsAg和HBeAg的时间及剂量依赖性抑制： AC在500 μg/mL时对HBsAg分泌的抑制率在24 h和48 h约为61%，96 h约为59%；TAF在100 μM时抑制率从24 h的约78%降至96 h的约46%。AC（500 μg/mL）与TAF（50 μM）联合使用时，HBsAg抑制率从24 h的约79%降至96 h的55%。对于HBeAg，AC在500 μg/mL时24 h抑制率约75%，96 h降至25%；TAF 100 μM时从24 h的约90%降至96 h的25%；联合用药在24 h达到94.55%的抑制率，48 h为80.78%，96 h为60.50%。结果表明联合治疗显著增强抗原抑制效果。

3.1.3 共培养系统中IL-6和HBcAg定量： AC在250 μg/mL时IL-6水平最低（872.4 pg/mL），500 μg/mL时略有回升（894 pg/mL）；TAF使IL-6从12.5 μM的1792.5 pg/mL降至100 μM的495.5 pg/mL。AC使HBcAg抑制率从17.18%增至49.82%，TAF从25.93%增至46.45%，均呈浓度依赖性。

3.1.4 qRT-PCR基因表达分析： AC处理24 h后，TLR4在500 μg/mL时下调约2²倍；TRIF在该浓度上调，提示免疫调节反应；iNOS在250 μg/mL时降低2²倍；IFNG在500 μg/mL时呈2¹倍上调趋势；CXCL10在250 μg/mL时下调2²倍；GPX1在500 μg/mL时上调2³倍；TGF-β在500 μg/mL时降至2¹倍；α-SMA在最高剂量时降至2²倍。此外，IRF7、ICAM1和p38-MAPK在500 μg/mL时下调，CCL2在各浓度下持续下调约2³倍。IRF3、MYD88、NF-κB、IL10、CASPASE-3/8/9等基因恢复至接近对照水平，纤维化相关基因（MMP9、MMP2、TIMP-1）和凋亡标志物（BAX、p53）在高剂量下也趋于正常。

3.1.5 逆转录酶抑制活性： AC在500 μg/mL时RT抑制率为25.06%，略高于TAF在100 μM时的21.71%。AC在250和125 μg/mL时抑制率分别为26.19%和24.05%，TAF在各浓度下抑制率介于21.71%至23.81%之间。

3.1.6 总酚和总黄酮含量： AC提取物的总酚含量（TPC）为0.04 ± 0.14至8.83 ± 0.04 mg GAE/g DW，总黄酮含量（TFC）为4.34 ± 0.11至19.28 ± 0.08 mg QE/g DW。

3.1.7 LC-MS分析： 共鉴定出12种植物化合物，包括黄酮类、甾醇类、脂肪酸和三萜类。正离子模式下检测到螺苷（spiraeoside）和槲皮素二葡萄糖苷（m/z 465.52和627.96）、亚麻酸（m/z 279.46）、植物甾醇（m/z 413.64）和齐墩果酸（m/z 454.7）；负离子模式下检测到含硫化合物（m/z 177.16）和异鼠李素-3-O-葡萄糖苷（m/z 477.6）。

3.2 计算分析结果

3.2.1 植物化合物挖掘与成药性评估： 从IMPPAT 2.0数据库共获得187种洋葱植物化合物，其中52种具有正药物相似性评分（>0）并含芳香环，进入后续研究。

3.2.2 毒性筛选与ADME分析： 52种化合物中39种被预测为非毒性。花旗松素（taxifolin）和芦丁（rutin）毒性较低，其Pa值分别为0.631和0.384，Pi值分别为0.023和0.271，均在可接受范围内。

3.2.3 植物化合物靶点预测： 39种化合物在SuperPred数据库中预测到2995个靶点，其中16个靶点与HBV诱导的肝脏炎症相关，包括NFKB1、CHUK、TLR4、STAT3、MAPK1、IKBKB、PIK3CA、HIF1A、STAT1、CXCR4、CASP8、PTGS2、TBK1、NOS2、CCR5和F2。

3.2.4 基因富集分析与网络构建： KEGG通路分析鉴定出117条通路，其中23条与肝脏炎症相关。乙型肝炎感染通路具有最低的FDR值。网络分析显示核黄素（riboflavin）是能调控大多数蛋白的重要植物化合物。

3.2.5 TLR4分子对接： 槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷（PubChem CID: 5320835）与TLR4（PDB ID: 3FXI）的对接评分最高（?14.23 kcal/mol），主要通过Phe 76的疏水相互作用和Tyr 102的一个氢键结合。槲皮素-7,4'-二葡萄糖苷（CID: 11968881）评分为?13.05 kcal/mol，与Val 93、Tyr 102和Arg 264形成3个氢键。槲皮素-4'-O-葡萄糖苷（CID: 5320844）评分为?11.86 kcal/mol。参考抑制剂MD2-TLR4-IN-1评分为?8.62 kcal/mol。

3.2.6 分子动力学模拟： 100 ns模拟显示，3FXI靶标RMSD为5.4 ?，化合物5320835的RMSD为8 ?。复合物在19.95至67.80 ns间无显著波动，表明配体稳定保留在活性口袋中。在68.35 ns处出现轻微偏差，随后在69.75 ns至100 ns间恢复稳定。模拟期间形成11个氢键，关键残基Phe 76（76%时间）和Tyr 102（59%时间）在整个模拟过程中保持强相互作用。

四、讨论与结论

讨论部分指出，现有核苷（酸）类似物虽能抑制HBV复制，但无法清除cccDNA或完全恢复免疫稳态。AC提取物通过多靶点机制发挥抗炎、抗氧化和抗纤维化作用。共培养实验中IL-6和HBcAg的下调支持其抗炎和抗病毒效应。基因表达谱显示TLR4、iNOS、CXCL10、TGF-β和α-SMA的抑制以及GPX1的上调，表明AC可减弱先天免疫激活、减少炎症介质产生、增强抗氧化防御并削弱促纤维化信号。TRIF和IFNG的上升提示定向免疫调节而非广泛免疫抑制。计算分析为实验观察提供了机制性假设，槲皮素-3,4'-二葡萄糖苷与TLR4-MD2复合物的持续结合支持TLR4作为关键靶点的合理性。研究结论为：AC甲醇提取物通过多靶点机制调节HBV相关病毒抗原分泌、炎症反应并发挥肝脏保护作用。AC-TAF联合用药可增强对HBsAg、HBeAg和HBcAg的抑制，同时下调HBV相关细胞内基因。AC还能通过抑制IL-6、iNOS和促纤维化介质TGF-β调节HBV相关炎症反应。AC的良好安全性和多靶点活性支持其作为慢性HBV感染辅助治疗的潜力，与TAF联合使用的增强效果进一步凸显其转化医学价值。未来研究应聚焦于药代动力学优化、活性植物成分分离、HBV DNA/cccDNA动态的详细评估以及体内验证。