黑、白阿萨伊（a?ai）种子乙醇提取物的体外抗氧化与细胞保护活性比较评价

《Chemistry & Biodiversity》：Comparative Evaluation of Ethanolic Extracts Obtained From the Seeds of White and Black A?ai Exhibit Antioxidant and Cytoprotective Activity In Vitro

　　

阿萨伊果实（Euterpe oleracea）因营养之外的生物活性特性而受到重视，其种子通常作为废弃物被丢弃。本研究评价了黑阿萨伊（BA）与白阿萨伊（WA）种子乙醇提取物的体外抗氧化、细胞毒性、细胞保护和基因毒性活性。采用DPPH、MTT和微核试验在正常（MNP01）及胃腺癌（ACP02）细胞系上进行检测，两种提取物均显示抗氧化活性（BA较WA约强30%）。未观察到细胞毒性或基因毒性效应，但两者在短期试验中均表现出细胞保护特性。在克隆形成试验中，BA（200 μg/mL）抑制两种细胞系的集落形成，但未干扰顺铂（cisplatin）的疗效。研究结果提示，阿萨伊种子提取物可提供短暂性细胞保护，可能归因于酚类含量和自由基清除作用，值得进一步研究其潜在治疗应用。

阿萨伊（a?ai, Euterpe oleracea）果实因营养之外的生物活性而受到关注，其种子在榨汁后多作为废弃物丢弃。种子是a?ai果实加工产生的主要副产物，产量大，带来处置与再利用问题；同时，果肉富含花青素，而种子提取物的植物化学成分需与果肉区分，花青素并非本研究种子乙醇提取物（ethanolic extract）的主要检出成分。为明确白阿萨伊（white a?ai, WA）与黑阿萨伊（black a?ai, BA）种子提取物是否具有抗氧化、细胞保护及安全性，研究人员开展了体外评价，以寻找在所测条件下具有抗氧化、细胞保护和低毒性的浓度。该研究的意义在于为a?ai种子农业废弃物的潜在功能与治疗应用提供依据。

关键技术方法概括：样本为2018年06/02采集于巴西帕拉州Santa Barbara市的黑、白阿萨伊种子农业废弃物，由 Dr. Maria do Socorro Padilha de Oliveira 鉴定，凭证号IAN 183.053（黑阿萨伊）和IAN 184.142（原文记为“with a?ai”），保存于IAN Herbarium（Belém, Pará, Brazil, Embrapa Amaz?nia Oriental）。研究采用分级体外策略：以Allium cepa生物试验初筛细胞遗传毒性；以正常胃细胞MNP01和胃腺癌细胞ACP02（RRID:CVCL_IK51）为对象，用DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，2,2-二苯基-1-苦基肼基）法测抗氧化，MTT（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide，3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴盐）法测细胞毒性与多柔比星（doxorubicin, DOX）共处理下的细胞保护，微核试验（micronucleus assay）测基因毒性，克隆形成试验（clonogenic assay）测长期集落形成及与顺铂（cisplatin）联用。

3.1 样品的化学表征：通过GC–MS（gas chromatography–mass spectrometry，气相色谱–质谱联用）分析衍生化后的BA与WA种子乙醇提取物，两种提取物均检出脂肪酸、酚类和缩合单宁；主要成分包括phloroglucinol（约24.71%与24.78%）、catecholactate（约18.79%与18.32%）、3,4-dihydroxybenzoic acid（约15.12%与15.26%）、palmitic acid（约12.11%与12.06%）等，未检出花青素。结论为两种种子提取物化学组成相近但存在定量差异。

3.2 抗氧化活性评价：DPPH自由基清除试验显示两种提取物均呈剂量依赖性抗氧化作用；BA的EC₅₀为9.8 μg/mL（95% CI：6.8–12.55 μg/mL），WA的EC₅₀为14.47 μg/mL（95% CI：7.05–14.59 μg/mL），BA抗氧化作用较WA约强30%。

3.3 细胞毒性活性评估：MTT法48 h暴露显示，BA与WA在胃腺癌细胞ACP02中未表现毒性；正常胃细胞MNP01在最高浓度400 μg/mL的两种提取物下活力降低。结论为细胞毒性反应存在细胞系差异，正常细胞仅在高浓度受影响。

3.4 细胞保护活性评价：MTT法将提取物与DOX共处理，BA与WA在200和400 μg/mL时对MNP01和ACP02均表现出对DOX诱导损伤的细胞保护作用。结论为两种提取物在短期试验中具有细胞保护特性。

3.5 基因毒性活性评价：微核试验显示，MNP01中两种提取物未引起微核形成或CBPI（cytokinesis-block proliferation index，胞质分裂阻滞增殖指数）改变；ACP02中CBPI亦无变化，BA的100和200 μg/mL微核频率与阳性对照无显著差异，其余处理与阳性对照不同。总体未观察到明确的基因毒性信号。

3.6 Allium cepa试验：以对乙酰氨基酚（paracetamol，0.3 mg/mL）诱导细胞遗传损伤，阿萨伊种子乙醇提取物（ethanolic extract of a?ai seed, EEAS）预处理使微核指数降低71.4%–81.1%，同时处理降低41%–67%，后处理的三个最高浓度分别降低71%、67%和73%，差异具统计学意义。结论为EEAS可减轻paracetamol诱导的细胞遗传损伤。

3.7 克隆形成试验：MNP01中仅200 μg/mL处理与处理间存在显著差异，未见明显集落形成变化；ACP02中各提取物处理间及与DMSO相比多无显著差异，除200 μg/mL和阳性对照外；随浓度升高平均集落数呈下降趋势但多不显著。提取物与顺铂联用未见集落形成且与阳性对照无显著差异，提示未降低顺铂疗效；摘要进一步指出BA 200 μg/mL抑制两种细胞系集落形成但不干扰顺铂疗效。

讨论部分总结：BA与WA化学组成的定量差异可解释BA抗氧化较WA约强30%，原文将BA中存在而WA中缺失的benzoic acid与其他成分活性增强相联系。MTT中细胞活力下降不超过20%，未能计算IC₅₀；微核试验未见明显基因毒性；缩合单宁虽曾被报道有毒性，但本研究未见，原文提出其含量低或与其他成分发生拮抗。正常MNP01在400 μg/mL受影响而ACP02不受，原文联系到a?ai种子提取物对多种癌细胞的细胞系依赖性选择毒性，并提出低浓度细胞保护、高浓度可能细胞毒的双相效应。细胞保护作用主要归因于酚类成分清除DOX产生的过量ROS（reactive oxygen species，活性氧）。A. cepa试验中，预处理降低微核71.4%–81.1%，原文提出可能与ROS直接中和和/或Nrf2/Keap1通路有关但未检测；后处理降低71%–73%，原文提出可能刺激DNA修复，涉及OGG1、ERK等假设；同时处理41%–67%，与paracetamol经CYP2E1/CYP3A4生成NAPQI（N-acetyl-p-benzoquinone imine，N-乙酰对苯醌亚胺）、谷胱甘肽耗竭及植物酚类影响细胞色素有关。克隆形成试验中25–100 μg/mL未显著降低两种细胞系集落形成，200 μg/mL才出现显著作用，原文将200 μg/mL视为安全阈值；主要酚类在低剂量作为氧化还原调节剂，脂肪酸占36.27%，其中palmitic acid和myristic acid为主，非毒性palmitic acid可诱导HSP70（heat shock protein 70，热休克蛋白70）。原文强调短期MTT与长期克隆形成试验的差异，提取物可维持短期存活但不能防止顺铂所致不可逆DNA损伤，未来需共培养、迁移和内源性抗氧化标志物研究，并认为a?ai种子作为农业废弃物具有再利用价值。

结论部分译述：研究结果显示，白阿萨伊与黑阿萨伊种子提取物均具有较强抗氧化特性，黑阿萨伊提取物略强于白阿萨伊。尽管如此，建议进一步研究两者的生物活性，包括其保护机体免受日常外部因素所致过量自由基形成损伤的潜力；捕获这些分子与预防或减轻癌症、糖尿病和心血管疾病症状相关。研究进一步指出，在所测条件和浓度下未观察到细胞毒性和基因毒性；观察到的细胞保护活性与本研究高度相关，并为研究团队后续步骤提供依据；这些发现为评估不仅来自阿萨伊果肉、也来自其种子的提取物的其他研究人员提供了有价值信息。