基于β-环糊精整体柱的Ficus tikoua Bur.抗类风湿关节炎活性成分筛选与富集

《Chemistry & Biodiversity》：Screening of Active Ingredients From Ficus tikoua Bur. Against Rheumatoid Arthritis and Their Enrichment Using a β-Cyclodextrin-Based Monolith

　　

Ficus tikoua Bur.为桑科（Moraceae）榕属（Ficus）多年生匍匐木质藤本，传统上用于类风湿关节炎（RA）的联合治疗。本研究旨在从Ficus tikoua Bur.中筛选抗RA活性成分。在活性测试前，通过调节富集流动相极性，利用自制β-环糊精（β-CD）基整体材料富集具有适宜极性和大小的化合物。采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法和酶联免疫吸附测定（ELISA）评价不同组分的抗炎活性。结果表明，Ficus tikoua Bur.中化合物对RAW264.7细胞活力无显著影响，同时有效降低炎症细胞因子白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌水平。当甲醇-水（30:70，v/v）混合物作为富集流动相时，吸附于整体柱上的组分对IL-6和TNF-α产生表现出最佳抑制作用。对最活性组分进一步分离和液相色谱-质谱联用（LC–MS）分析，结合文献数据，4-hydroxy-3,5-bis(3^′-methyl-2-butenyl) benzoic acid-O-β-D-glucopyranoside可能是主要抗炎成分。富集条件优化显示，该整体材料对筛选化合物的富集因子达到15.352。

研究背景：传统中药（TCM）具有简便、有效和副作用较低等优势，但多数草药因多组分复杂导致药理机制不清，限制了其现代化和全球接受。Ficus tikoua Bur.为桑科榕属多年生匍匐木质藤本，主要药用部位为茎和叶，具有清热、利湿、解毒、消肿等作用，在土家族民族药中归为风寒湿痹药并用于联合治疗类风湿关节炎（RA），在苗族传统药中鲜叶捣烂外敷用于早期乳腺炎消肿。RA是系统性自身免疫功能障碍的代表性疾病，以持续性滑膜炎为特征，典型临床表现为对称性多关节受累和进行性骨侵蚀，全球患病率为0.5%～1.0%，目前仍不可治愈，治疗主要集中于减轻炎症、缓解疼痛和晨僵、改善症状及控制疾病进展，但长期药物治疗存在胃肠道、心血管、肝肾毒性和感染易感等多系统不良反应风险，且高成本和长疗程给患者及医疗系统带来心理和社会经济负担。因此，从传统中药中寻找抗RA活性成分具有现实需求。β-CD由7个α-D-吡喃葡萄糖单元经β-1,4-糖苷键连接而成，具有疏水空腔，因主客体包合性质和可功能化潜力而用于药物分离、制剂开发和分析化学；有机聚合物整体柱作为固相萃取（SPE）吸附剂可选择性吸附目标化合物。基于此，Dan Zhang等研究人员制备β-CD基整体柱并用作SPE吸附剂，与高效液相色谱（HPLC）联用，通过调节富集流动相极性富集和纯化Ficus tikoua Bur.中具有适宜极性和大小的化合物，再用CCK-8和ELISA筛选不同组分的抗炎活性，并对活性组分进一步分离以发现抗RA成分。研究结论提示，该方法可快速富集分离Ficus tikoua Bur.化学成分，并通过活性追踪鉴定出具有一定抗炎活性的化合物，为从Ficus tikoua Bur.中发现治疗剂提供依据。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员以丙烯酰-β-CD（A-β-CD）与苯乙烯为单体、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯（TMPTA）为交联剂、十二醇和聚乙二醇200（PEG200）为致孔剂、偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂原位聚合制备β-CD基整体柱，并用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、扫描电子显微镜（SEM）和氮吸附-脱附分析（BET法）表征；将整体柱用于在线SPE-HPLC富集分离，结合CCK-8和ELISA进行活性追踪，采用反相半制备色谱进一步分离，以LC–MS和Molisch反应鉴定结构并计算富集因子。样本来源：Ficus tikoua Bur.采自四川省宜宾市（2024年4月11日），凭证标本（20240411）存于河北大学；RAW264.7细胞购自中国科学院。

研究结果：
2.1 丙烯酰-β-CD的表征：研究人员通过酯化反应合成A-β-CD，FTIR谱中1727 cm^?1处出现归属于酯化丙烯酰基C=O伸缩振动的明显吸收带，确认A-β-CD成功合成；C=C伸缩振动与β-CD羟基面内弯曲振动吸收带显著重叠，限制了C=C伸缩振动的准确识别。
2.2 β-CD基整体柱的优化：研究人员合成H1—H9系列β-CD基整体材料，系统考察单体、交联剂和致孔剂对渗透性的影响；与不含A-β-CD的H2相比，含A-β-CD的H1和H3背压显著降低、渗透性改善，A-β-CD过量会削弱机械强度，故选择0.0008 g A-β-CD；综合评价后H1性能最佳并用于后续研究，H2作为无β-CD对照。
2.3 β-CD基整体柱的表征：SEM显示含β-CD和不含β-CD的整体材料均呈棉状多孔结构；BET分析显示β-CD基整体材料为IV型等温线，提示介孔结构，而不含β-CD者为III型等温线，提示大孔或无孔材料；β-CD基整体材料比表面积为94.79 m²/g，为不含β-CD材料（23.89 m²/g）的四倍，且β-CD加入提高微观结构均一性并降低背压，整体柱具有良好机械性能。
2.4 Ficus tikoua Bur.化学成分对脂多糖诱导RAW264.7细胞活力的影响：研究人员用CCK-8法评价细胞活力，将各组分以500 μg/mL作用于RAW264.7细胞，并在细胞毒性实验中加入脂多糖（LPS）模拟炎症微环境；结果显示各处理组与对照组细胞活力无统计学显著差异，说明Ficus tikoua Bur.提取物化学成分在500 μg/mL及以下对RAW264.7巨噬细胞无明显细胞毒性，为后续抗炎活性研究提供安全剂量依据。
2.5 Ficus tikoua Bur.化学成分对LPS诱导RAW264.7细胞炎症因子的影响：研究人员用ELISA定量LPS刺激RAW264.7巨噬细胞中TNF-α和IL-6，结果显示F8显著抑制LPS诱导的IL-6和TNF-α分泌。
2.6 F8的分离及后续RAW264.7细胞CCK-8和ELISA分析：研究人员用反相半制备柱分离F8，按保留时间收集R1—R6六个亚组分；CCK-8显示在200 μg/mL范围内无明显细胞毒性；ELISA显示R5对LPS诱导巨噬细胞炎症模型中IL-6和TNF-α表达具有显著且特异的抑制作用。R5再经半制备反相色谱分离，收集Fraction 1；不同浓度Fraction 1与IL-6、TNF-α和IL-1β的关系显示最佳浓度为100 μg/mL。原文指出Fraction 1作为天然抗炎剂具有前景，但仍需多细胞系体外筛选、体内验证、与已验证参考化合物比较以及建立抗RA分子机制或疗效等进一步探索。
2.7 Fraction 1的结构确定：LC–MS检测到Fraction 1的质子化分子离子[M+H]⁺为m/z 437.1936，与Jiang et al.报道的Ficus tikoua Bur.中已知化合物的钠加合物[M+Na]⁺（m/z 459.1986）一致，故Fraction 1可能为4-hydroxy-3,5-bis(3^′-methyl-2-butenyl) benzoic acid-O-β-D-glucopyranoside，分子式为C₂₃H₃₂O₈；Molisch反应在相界面出现特征紫色环，确认Fraction 1含糖苷结构。
2.8 β-CD基整体柱对Fraction 1的富集能力：研究人员系统评价富集流动相组成，将Ficus tikoua Bur.提取物注入整体柱后用不同富集流动相洗去非吸附组分，再用乙腈洗脱吸附组分并在C18分析柱上分离；结果显示乙腈-水（60:40，v/v）作为富集流动相时Fraction 1富集效率最高且除杂效果更优；含β-CD的H1较不含β-CD的H2对Fraction 1富集能力显著增强且除杂更有效，可能归因于β-CD疏水空腔与外表面亲水羟基同Fraction 1形成疏水作用、氢键和范德华力等多种作用；计算得Fraction 1富集因子为15.352。

讨论部分总结：研究人员认为β-CD在扩大可及表面积、形成介孔和提供环糊精空腔主客体相互作用方面具有关键作用，从而增强吸附能力；整体柱的低背压和机械稳定性是在线SPE吸附剂的重要性能指标，β-CD加入可降低背压并改善微孔通道。活性追踪显示F8、R5和Fraction 1具有抗炎活性，Fraction 1作为天然抗炎剂具有前景，但原文同时指出仍需多细胞系体外筛选、体内验证、与已验证参考化合物比较以及建立抗RA分子机制或疗效等进一步探索。研究结论翻译：本研究系统考察了Ficus tikoua Bur.中具有潜在抗RA活性的生物活性成分。以自制β-CD基整体柱作为SPE吸附剂，通过调节流动相组成，可按极性和大小快速富集并分离Ficus tikoua Bur.中的化学成分。通过活性追踪和进一步分离，鉴定出一种化合物，该化合物表现出一定的抗炎活性。