叶酸与维生素B12对慢性伊维菌素诱导的雄性大鼠生殖损伤的保护作用：氧化应激、免疫组织化学变化（Caspase-3、Bax、BCL2和PCNA表达）及线粒体16S rRNA分析

《Chemistry & Biodiversity》：Protective Role of Folic Acid and Vitamin B12 Against Chronic Ivermectin-Induced Reproductive Damage: Oxidative Stress, Immunohistochemical Changes (Caspase-3, Bax, BCL2, and PCNA Expressions) and Mitochondrial 16S rRNA Analysis

本研究旨在探讨叶酸（folic acid, FA）和维生素B12（vitamin B12, Vit.B12）对高剂量伊维菌素（ivermectin, IVM）在雄性大鼠睾丸组织中引起的生殖激素、精液质量、氧化/抗氧化状态、组织病理学变化及免疫组织化学指标（Caspase-3、Bax、BCL2和PCNA）损伤的保护作用。研究人员将28只大鼠随机分为四组：对照组、伊维菌素组、伊维菌素+叶酸组和伊维菌素+维生素B12组。IVM给药剂量为5 mg/kg/天，叶酸为20 mg/kg，维生素B12为50 μg，并明确了各自的给药途径及30天的处理周期。研究人员评估了睾酮水平和精液参数，检测了睾丸样本的氧化/抗氧化标志物、组织学变化及免疫组织化学表达，并对线粒体16S rRNA序列进行了分析，序列已提交至GenBank，登录号为PP320440.1–PP320443.1。结果显示，IVM显著降低了睾酮水平、精子数量和抗氧化指标，同时增加了氧化应激水平。IVM组观察到生精小管损伤。免疫组织化学分析显示IVM组Caspase-3和Bax表达增强，而BCL2和PCNA表达模式发生改变。16S rRNA序列分析显示各实验组间序列变异有限。叶酸或维生素B12联合处理显著改善了IVM影响的所有参数。这些研究结果表明，FA和Vit.B12可能对IVM相关的睾丸改变具有保护作用。

一、研究背景与目的

伊维菌素（ivermectin, IVM）是一种广泛应用于动物和人类的抗寄生虫药物，除抗寄生虫活性外，还显示出抗病毒、抗菌和抗癌等特性。尽管在治疗剂量下通常被认为是安全的，但反复或高剂量暴露与不良生殖效应相关，包括睾丸体积减少、生精小管直径减小、生精上皮变薄、精子生成受损及形态异常等。组织学分析显示，IVM可导致生殖细胞核改变和细胞器聚集，干扰正常减数分裂并影响精子形态。此外，高剂量IVM还与睾酮水平降低有关，可能对动物繁殖产生负面影响，进而影响畜牧生产力及食品安全。因此，寻找能够减轻该广泛使用药物生殖毒性的干预剂具有重要科学意义。

叶酸（folic acid, FA）和维生素B12（vitamin B12, Vit.B12）作为B族维生素，具有抗炎和神经保护作用，在生殖健康领域受到广泛关注。叶酸在DNA合成、胺代谢、氨基酸合成和细胞分裂中发挥关键作用，其抗氧化特性可支持精子发生并改善精子形态和浓度。维生素B12对血细胞和DNA形成至关重要，参与细胞代谢及DNA完整性维持，与精液质量改善相关。已有研究证实Vit.B12对IVM诱导的肝脏和肾脏毒性具有保护作用。基于此，本研究假设FA和Vit.B12能够减轻高剂量IVM对雄性大鼠生殖功能和睾丸组织的不利影响，评估其对遗传变异、生殖激素水平、精液质量、氧化/抗氧化平衡、组织病理学变化及免疫组织化学标志物（Caspase-3、Bax、BCL2和PCNA）的改善作用。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员将28只成年雄性Wistar白化大鼠（13-15周龄，平均体重200±20 g）随机分为四组（每组7只）：对照组（口服0.9% NaCl溶液）、IVM组（皮下注射5 mg/kg/天IVM）、IVM+FA组（IVM同剂量皮下注射联合20 mg/kg叶酸口服）和IVM+Vit.B12组（IVM同剂量皮下注射联合50 μg维生素B12肌肉注射），处理周期为30天。主要技术方法包括：采用Elecsys Testosterone II测定血清睾酮水平；通过附睾尾精子采集进行精液分析（精子计数、活力和存活率）；使用ELISA试剂盒检测睾丸组织匀浆中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和总抗氧化能力（TAC）；H&E染色进行组织病理学检查；免疫组织化学检测Caspase-3、Bax、BCL2和PCNA表达，并使用ImageJ软件进行定量分析；扩增并测序线粒体16S rRNA区域，序列提交至GenBank（登录号PP320440.1–PP320443.1），采用Kimura 2-参数模型计算遗传距离。

三、研究结果

3.1 血清睾酮与精子计数、活力和运动性

结果显示，IVM组睾酮水平（0.89±0.07 nmol/L）较对照组（1.002±0.24 nmol/L）显著降低。FA和Vit.B12联合给药分别将睾酮水平提升至0.97±0.69和1.057±0.12 nmol/L，接近对照组水平。IVM显著降低精子数量和活精子百分比，同时增加死精子百分比。FA和Vit.B12联合处理组精子数量、活精子百分比显著升高，死精子百分比显著降低，几乎恢复至对照组水平。IVM组精子呈非进行性运动（进行性运动为0%），FA联合组进行性运动恢复至31.00±5.47%，接近对照组（35.00±7.07%），Vit.B12联合组进行性运动显著提高至66.50±4.95%，优于对照组。

3.2 氧化应激与抗氧化谱评估

IVM组睾丸组织MDA水平（18.23±1.03 nmol/ml）较对照组（7.57±0.50 nmol/ml）显著升高，表明脂质过氧化增强。IVM组SOD（31.05±3.06 U/ml）和CAT（70.13±1.40 U/ml）水平较对照组（43.28±2.56和129.4±1.25 U/ml）显著降低。FA和Vit.B12联合处理显著降低MDA水平（分别为10.62±0.69和9.65±0.48 nmol/ml），并显著提高SOD（98.65±7.52和85.23±6.97 U/ml）、CAT（103.3±5.82和95.95±4.18 U/ml）和TAC水平（61.17±2.13和48.72±3.02 U/ml），显示抗氧化保护作用。

3.3 睾丸组织病理学发现

对照组睾丸切片显示正常生精小管，具有规则轮廓和完整生精细胞系列，管腔含大量成熟精子。IVM组显示小管结构紊乱、不规则、生精上皮变性、炎性细胞浸润和空泡化，管腔大多缺乏精子，表明精子发生受损。IVM+FA和IVM+Vit.B12组均显示显著的结构改善，生精小管与对照组高度相似，提示对IVM诱导的睾丸损伤具有保护作用。

3.4 睾丸免疫组织化学反应

Caspase-3免疫组织化学显示IVM组阳性反应显著增强，表明凋亡活性增加；FA和Vit.B12联合处理显著下调Caspase-3表达，接近正常水平。Bax表达模式与Caspase-3相似，IVM组显著增强，联合处理组显著降低。BCL2在IVM组表达显著降低，表明抗凋亡活性受抑；FA和Vit.B12联合处理显著上调BCL2表达。PCNA在IVM组表达显著下降，表明细胞增殖减少；联合处理组PCNA免疫反应性显著恢复，接近对照组水平。定量分析证实了上述变化，且IVM+Vit.B12组在抑制凋亡和促进增殖方面效果优于IVM+FA组。

3.5 遗传学结果

PCR扩增获得556 bp的16S rRNA片段，四组序列已提交GenBank（PP320440.1–PP320443.1）。核苷酸频率分析显示所有组A+T含量高于C+G含量，IVM+FA组A+T含量最高（61.01%），IVM+Vit.B12组最低（60.47%）。遗传距离分析显示对照组与IVM组之间遗传距离为0.0018-0.0019，表明存在序列变异；而IVM组与IVM+FA组、IVM+Vit.B12组之间遗传距离为0.0018，对照组与两个联合处理组之间遗传距离为0.0000，表明FA和Vit.B12使16S rRNA序列恢复至接近对照组状态。

四、讨论与结论

讨论部分指出，IVM诱导的生殖毒性可能与睾丸GABA能受体作用、活性氧（ROS）介导的氧化损伤及线粒体依赖性凋亡通路激活有关。FA和Vit.B12通过其抗氧化特性、DNA合成支持和DNA甲基化参与，减轻了IVM引起的氧化应激、细胞凋亡和遗传变异。16S rRNA分析显示有限序列变异，但研究人员明确指出该结果不应被解释为基因组DNA损伤或遗传毒性的直接证据。

研究结论为：慢性IVM暴露对雄性大鼠的睾酮水平、精液质量、睾丸抗氧化状态、组织学结构和增殖性免疫组织化学标志物产生不利影响；FA或Vit.B12联合给药改善了这些改变；线粒体16S rRNA分析显示各实验组间序列变异有限，但分子发现不应视为遗传毒性的直接证据；需要进一步使用专门的DNA损伤检测方法来阐明慢性IVM暴露的潜在遗传毒性效应。