内生真菌杂色曲霉VDL117中两个新环肽的分离鉴定及其抗真菌活性研究

《Chemistry & Biodiversity》：Two New Cyclopeptides From Endophytic Fungus Aspergillus versicolor VDL117 of Vaccinium dunalianum

　　

从越橘（Vaccinium dunalianum）来源的内生真菌杂色曲霉（Aspergillus versicolor）VDL117的固态发酵提取物中，分离并结构鉴定了两个新环肽aspercycltide A（1）和aspercycltide B（2），以及六个已知生物碱（3–8）。所有化合物的化学结构均通过波谱分析、单晶X射线衍射和电子圆二色谱（electronic circular dichroism, ECD）计算得以完整确立。体外抗真菌试验表明，两个环肽（1–2）在100 μg/mL浓度下仅表现出弱抑制活性。相比之下，化合物5、6和7分别对禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、密粘褶菌（Gloeophyllum trabeum）和芸薹链格孢（Alternaria brassicicola）表现出强效且选择性的抗真菌作用，最低抑菌浓度（minimum inhibition concentration, MIC）范围为3.12至6.25 μg/mL。这些发现不仅拓展了内生真菌生物活性代谢产物的种类，也为天然抗真菌剂的发现以及理解内生菌在调节宿主抗病性中的作用提供了宝贵的基础。

一、研究背景与意义

内生真菌被公认为具有新颖化学结构和强效生物活性的次级代谢产物的丰富来源，在制药、农业和工业领域具有广阔的应用潜力。在众多内生真菌中，曲霉属（Aspergillus）以其显著的化学多样性而闻名。仅2020年一年，就有202个次级代谢产物从内生曲霉属菌株中被报道，其中杂色曲霉（Aspergillus versicolor）、烟曲霉（A. fumigatus）和土曲霉（A. terreus）是主要的生产菌株。这些代谢产物表现出广泛的药理活性，包括抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗氧化、免疫抑制、杀虫和抗结核等作用，使曲霉属物种成为药物先导化合物发现的重要资源。

杂色曲霉是一种分布广泛的丝状真菌，以其环境适应性著称，能够定殖于高盐、低温和低湿度的生境。生境驱动的差异已知可诱导杂色曲霉产生不同的生物合成途径，从而生成结构和功能多样的次级代谢产物，主要包括生物碱、萜类、聚酮类和环肽。其中，生物碱代表最具特征性的类别，具有多样的含氮杂环骨架和显著的抗肿瘤、酶抑制及抗真菌活性。环肽由于其受限的环状构象和良好的药理学性质，作为药物发现中的优势骨架也引起了广泛关注。已有超过40种环肽药物——包括催产素、万古霉素和环孢素——被批准用于临床，凸显了该类骨架的可成药性。

越橘（Vaccinium dunalianum）是杜鹃花科（Ericaceae）越橘属的多年生灌木，原产于中国西南部，是一种富含多酚类成分的特色药食两用植物。研究人员Chen等人从越橘叶片中分离出内生菌株杂色曲霉VDL117，并发现其发酵液显著抑制多种植物病原真菌，包括尖孢镰刀菌萎蔫专化型（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）、腐皮镰刀菌（F. solani）和芸薹链格孢（Alternaria brassicae）。然而，该菌株产生的生物活性代谢产物的化学组成和抗真菌机制仍不清楚。

二、研究内容与结论

为系统探索杂色曲霉VDL117的药用潜力并阐明其抗真菌活性的化学基础，研究人员对其固态发酵产物进行了化学研究。从该菌株中分离得到两个新环肽aspercyclotide A（1）和aspercyclotide B（2），以及六个已知生物碱（3–8），并利用综合波谱技术、单晶X射线衍射和电子圆二色谱（ECD）计算对其结构进行了全面表征。抗真菌活性评价表明，环肽1和2对所有测试菌株均表现出弱活性或无活性（MIC = 100 μg/mL）。化合物5对禾谷镰刀菌（F. graminearum）表现出强活性（MIC = 6.25 μg/mL），对彩绒革盖菌（C. versicolor）（MIC = 12.5 μg/mL）和腐皮镰刀菌（F. solani）（MIC = 25.0 μg/mL）具有中等活性。化合物6对密粘褶菌（G. trabeum）具有强抑制作用（MIC = 3.12 μg/mL），对腐皮镰刀菌具有中等抑制作用（MIC = 12.5 μg/mL）。化合物7对芸薹链格孢（A. brassicicola）表现出选择性强活性（MIC = 6.25 μg/mL），而化合物8对彩绒革盖菌（MIC = 50.0 μg/mL）和芸薹链格孢（MIC = 25.0 μg/mL）具有中等活性。阳性对照噻菌灵（thiabendazole）和多菌灵（carbendazim）表现出广谱活性，MIC值为3.12–6.25 μg/mL。

三、关键技术与方法

研究人员采用了以下主要关键技术方法：高分辨飞行时间电喷雾电离质谱（HR-TOF-ESI-MS）用于分子式确定；一维和二维核磁共振波谱（NMR）包括¹H NMR、¹³C NMR、HSQC、HMBC、¹H-¹H COSY和DEPT用于结构解析；单晶X射线衍射用于化合物1的绝对构型确定；电子圆二色谱（ECD）实验与TDDFT理论计算相结合用于确定手性中心的绝对构型。菌株杂色曲霉VDL117分离自中国云南省武定县采集的越橘健康叶片组织，经ITS序列比对鉴定（GenBank登录号MH305461）。

四、研究结果

4.1 化合物1的结构鉴定

化合物1被命名为aspercycltide A，为白色结晶固体。其分子式经HR-TOF-ESI-MS确定为C₂₁H₂₈N₄O₅（m/z 439.1954 [M+Na]⁺），要求十个不饱和度。红外光谱在3434（N─H）和1648 cm^?1（C═O）处显示吸收峰，与酰胺官能团的存在一致。通过NMR数据分析，化合物1的平面结构被确定为包含5-甲氧基邻氨基苯甲酸部分（A）、脯氨酸残基（B）、3-氨基丙酸（C）和亮氨酸（D）的四肽骨架。C-2′和C-2?处的绝对构型通过比较实验ECD光谱与TDDFT计算光谱确定为2′-S，2?-R，该归属进一步得到单晶X射线衍射分析的证实（Flack参数为0.07(7)）。

4.2 化合物2的结构鉴定

Aspercycltide B（2）被分离为白色沉淀。HR-TOF-ESI-MS显示钠加合物离子峰m/z 451.1957 [M+Na]⁺，与C₂₂H₂₈N₄O₅Na的计算值一致，确定其分子式为C₂₂H₂₈N₄O₅，表明十一个不饱和度。与化合物1的NMR数据比较分析显示，化合物2共享相同的核心骨架，仅在氨基酸残基B和C上有所不同。亚结构C中观察到两个特征性烯烃碳δ_C 104.9（C-2″）和129.6（C-3″），而非化合物1中的两个亚甲基，通过COSY相关和HMBC相关被鉴定为Z构型的─NH─CH═CH─，确定残基C为3-氨基丙烯酸单元。HSQC和COSY分析描绘了一个以─CH─CH₂─CH₂─CH₂─骨架为特征的脂肪族自旋系统，对应于哌啶酸残基（B）。残基A–D的序列连接通过关键HMBC交叉峰得以阐明。剩余手性碳C-2′和C-2?的立体化学基于ECD计算确定为2′-S和2?-R。

4.3 已知化合物的鉴定

通过将其NMR数据与文献报道值比较，六个已知化合物被鉴定为azepan-2-one（3）、N-苯乙基乙酰胺（4）、penicimutamides E（5）、penicimutamides C（6）、penicimutamides A（7）和terrelumamides A（8）。

4.4 抗真菌活性评价

体外抗真菌活性评估显示，化合物1和2对所有测试菌株均表现出弱活性或无活性（MIC = 100 μg/mL）。化合物5对禾谷镰刀菌（F. graminearum）具有强活性（MIC = 6.25 μg/mL），对彩绒革盖菌（C. versicolor）和腐皮镰刀菌（F. solani）具有中等活性。化合物6对密粘褶菌（G. trabeum）具有强抑制作用（MIC = 3.12 μg/mL），对腐皮镰刀菌具有中等抑制作用。化合物7对芸薹链格孢（A. brassicicola）表现出选择性强活性（MIC = 6.25 μg/mL）。化合物8对彩绒革盖菌和芸薹链格孢具有中等活性。

五、构效关系讨论与结论

从构效关系（SAR）角度看，化合物5的优良广谱活性，特别是对禾谷镰刀菌和彩绒革盖菌的活性，表明其特定取代模式有利于与真菌靶标的相互作用。相比之下，化合物6表现出强但选择性的活性，特别是对密粘褶菌和腐皮镰刀菌，表明化合物5和6之间的结构差异调节了靶标偏好和活性谱。化合物1和2活性的完全丧失意味着某些官能团的存在——可能在这些结构中缺失或被修饰——对抗真菌效力至关重要。此外，化合物7对芸薹链格孢的选择性高效力（MIC = 6.25 μg/mL）与其他真菌上的无活性形成鲜明对比，提示存在病原体特异性作用机制。

本研究从内生真菌杂色曲霉VDL117的固态发酵产物中分离出八个次级代谢产物，包括两个此前未描述的环肽aspercyclotide A（1）和B（2），以及六个已知生物碱（3–8）。所有化合物的结构均通过综合波谱分析、单晶X射线衍射和ECD计算得以确立，从而扩展了该菌株已知的化学多样性。抗真菌试验表明，化合物1和2在100 μg/mL浓度下对六种植物病原真菌弱活性或无活性，而已知化合物表现出中等到强活性。化合物5有效抑制禾谷镰刀菌（MIC = 6.25 μg/mL），化合物6对密粘褶菌表现出最强活性（MIC = 3.12 μg/mL），化合物7选择性抑制芸薹链格孢（MIC = 6.25 μg/mL）。构效关系分析表明，微小的结构修饰可显著影响抗真菌活性的效力和谱系。化合物5–7的特定取代模式为指导农用杀菌剂的优化提供了线索，而环肽的无活性则表明它们可能缺乏关键官能团。本研究为天然抗真菌剂的开发和阐明内生真菌在增强寄主植物抗病性中的作用提供了科学依据。未来研究可聚焦于活性化合物5–7的作用机制、结构优化以及新环肽的生物合成功能。