Giemsa与Hemacolor染色比较揭示鸟类白细胞谱系的系统性差异

《Ecology and Evolution》：Comparison of Giemsa and Hemacolor Staining Reveals Systematic Differences in Avian Leukocyte Profiles

　　

从血涂片中准确识别鸟类白细胞分类高度依赖于染色方法。本研究基于39只大山雀（Parus major）的配对样本，对Giemsa与Hemacolor染色进行了比较评估，整合了定性与定量评估。经Hemacolor染色的血涂片所得白细胞谱系显示异嗜性粒细胞（heterophil）计数显著升高，且异嗜性粒细胞/淋巴细胞比值（H:L ratio，即heterophil-to-lymphocyte ratio）约高出40%；而Giemsa染色血涂片则产生更高的淋巴细胞比例；嗜酸性粒细胞（eosinophil）计数在两种方法间无显著差异。这些定量差异与显微特征一致：Hemacolor形成较明亮视野，异嗜性粒细胞颗粒边界清晰，而Giemsa提供更强的细胞核对比度，有利于淋巴细胞识别。两种染色方法间稳定且同向的差异表明白细胞评估中存在系统性偏差。由于两种方法侧重不同的细胞特征，所获白细胞谱系不可互换，这对生态学与生理学解释具有重要意义。因此，应明确报告染色方案，并在同一数据集内始终如一地采用单一染色方法。

**研究背景与问题**
数十年来，血液参数一直被用作包括鸟类在内的生物体健康与生理状况的指示指标。常见禽类血液学指标包括血红蛋白浓度、红细胞计数、平均红细胞体积（MCV）、血细胞比容以及各类白细胞的数量和相对比例，其中异嗜性粒细胞/淋巴细胞比值（H:L ratio）尤为重要。与哺乳动物不同，禽类红细胞具有细胞核，因此无法使用针对无核哺乳动物红细胞校准的自动化血液分析仪，自动染色/计数设备也不适用于禽类血涂片。Giemsa和Hemacolor等Romanowsky型染色方法广泛应用于禽类血液学，二者均为外周血涂片制备中的常用技术，但在染色时间、对比度强度以及对固定、pH条件和试剂质量相关伪影的敏感性方面存在差异，可能影响细胞核与细胞质结构的清晰度以及粒细胞系特征颗粒的可见性。由于H:L比值常被概括为白细胞再分布的指标，并广泛用作生理状况和环境应激的代理指标，影响白细胞识别的操作因素可能直接干扰结果的生物学解释。本研究旨在检验染色方法的选择是否会导致白细胞计数和H:L比值的系统性差异，并评估这种差异是否会使基于白细胞指标的生态学与生理学解释产生偏倚。

**研究设计与方法**
研究材料于2024年1月5日至26日采集自波兰中部一项关于大山雀生理状况的长期研究项目，数据集包含39只大山雀（27雄、12雌）的样本。研究人员使用标准雾网（长5 m）在09:00至13:00捕获鸟类，每只鸟佩戴铝制环标并鉴定性别。从每只个体的尺静脉采集两份血液样本（约5–10 μL），分别制备配对血涂片，一张采用Giemsa染色，另一张采用Hemacolor染色。白细胞分类依据Campbell（1995）和Canfield（1998）描述的形态学标准，染色涂片在1000×油浸镜下使用MBL-320T光学显微镜检查，每张涂片计数100个白细胞。所有计数均由单一观察者（J.S.）对每张涂片重复进行两次，并通过组内相关系数（ICC）评估观察者内重复性。由于白细胞比例和H:L比值不符合正态分布假设，研究人员采用非参数配对检验。使用Wilcoxon符号秩检验评估两种染色方法间的差异，并额外进行符号检验作为仅检验变化方向的保守检验。所有检验均为双尾，统计软件为Statistica 13。

**研究结果**
Wilcoxon符号秩检验结果显示，Hemacolor染色涂片的异嗜性粒细胞计数显著高于Giemsa，淋巴细胞比例显著低于Giemsa，且H:L比值显著更高；嗜酸性粒细胞计数在两种方法间无显著差异。符号检验给出了相同的定性结论：异嗜性粒细胞比例在39只个体中有37只在Hemacolor涂片中更高，淋巴细胞比例在39只个体中有36只在Giemsa涂片中更高（1只个体数值相同），H:L比值在37只个体中表现为Hemacolor中更高。这些结果说明差异并非由少数极端观测驱动，而是个体间高度一致的方向性变化。效应的生物学相关性通过大效应量得到支持：异嗜性粒细胞（r=0.83）、淋巴细胞（r=0.84）和H:L比值（r=0.85），而嗜酸性粒细胞效应量较小（r=0.20）。观察者内重复性对主要白细胞变量较高：异嗜性粒细胞的ICC为0.95–0.96，淋巴细胞为0.89–0.95，H:L比值为0.85–0.95；嗜酸性粒细胞重复性较低（ICC=0.42–0.60），可能因其在涂片中丰度较低。定性染色特征方面，Hemacolor提供更清晰的异嗜性粒细胞颗粒可视化，而Giemsa增强细胞核对比度并促进淋巴细胞识别。两种方法在整体视野色调、各种白细胞颗粒颜色和核形态等方面存在系统差异，如Hemacolor总体色调较浅，Giemsa核对比更强，这些均与定量结果一致。代表性血涂片图像和诊断特征对比表进一步说明了差异。

**讨论与结论**
本研究表明，染色方法的选择可导致禽类白细胞谱系出现一致且系统性的差异，而非随机波动，反映的是方法学偏倚而非测量噪声。这些差异源于两种染色在对比度、显色强度和细胞质/核结构可视化上的不同，从而直接影响白细胞分类及后续定量估计。由于H:L比值被广泛用作生态和进化研究中的生理应激和免疫状态代理指标，染色方法引起的白细胞相对比例改变可能使不同研究、种群或时间段的H:L比值无法直接比较。更重要的是，本研究中个体间差异方向的高度一致性表明存在定向偏移，这意味着使用不同染色方法生成的数据集可能产生系统性不同的生理状况估计值，从而可能误导生态学模式解释。这种偏倚在比较种群、评估时间趋势或整合多数据集结果的研究中尤为关键，源于环境条件、栖息地质量或生活史变异的表观差异，可能部分反映的是方法学不一致而非真实生物学差异。最终结论强调，染色方法是禽类白细胞谱系中一个重要的非中性变异来源；Hemacolor倾向于产生更高的异嗜性粒细胞比例和H:L比值，而Giemsa导致相对较高的淋巴细胞计数，因此两种方法产生的定量结果具有系统性差异。由于H:L比值广泛用于生理状况和环境应激指标，基于不同染色方法得到的H:L比值不应视为可直接比较。研究人员强调，研究内部必须严格执行方法学一致性，应明确报告染色方案以保证透明度和数据集间的可比性，避免在同一数据集中混用染色方法，以免引入与生物学过程无关的人为变异。