局部布洛芬洗脱静电纺丝膜通过抑制巨噬细胞相关成纤维细胞活化预防输尿管纤维化

《Materials Today Bio》：An Ibuprofen-Eluting Electrospun Membrane Prevents Ureteral Fibrosis by Dampening Macrophage-Associated Fibroblast Activation

　　

背景：输尿管狭窄由未消退的炎症和进行性基质沉积驱动，然而机制指导的局部治疗仍然有限。方法：研究人员将人类正常输尿管与狭窄输尿管的空间转录组学（spatial transcriptomics）与来自3例狭窄标本的内部单细胞RNA测序（scRNA-seq）参考相结合，并利用正常输尿管数据集GSE194129独立评估细胞注释。采用输尿管上皮损伤条件培养基（UICM）、原代输尿管成纤维细胞和THP-1衍生巨噬细胞模拟上皮-免疫-基质信号传导。对布洛芬功能化的聚己内酯/明胶静电纺丝膜（P/G-PLL-IBU）进行表征，并在兔输尿管热损伤模型中进行测试。结果：空间分析识别出狭窄区域中成纤维细胞与巨噬细胞程序共富集的纤维炎症微环境。低正常参考特征点显示细胞骨架重塑相关特征。UICM中IL-6（interleukin-6）和HMGB1（high-mobility group box 1）水平升高、LDH（lactate dehydrogenase）释放增加，诱导炎症性成纤维细胞样状态，并产生以促炎特征为主的巨噬细胞活化状态。来自UICM激活巨噬细胞的条件培养基增强UICM预激活成纤维细胞中FN1（fibronectin 1）、COL1A1（collagen type I alpha 1 chain）、α-SMA（alpha-smooth muscle actin）和Smad2/3磷酸化。可溶性布洛芬抑制巨噬细胞NF-κB（nuclear factor kappa-B）/COX-2（cyclooxygenase-2）相关活化，处理培养物的条件培养基在成纤维细胞中引发较低的促纤维化反应。PGE₂（prostaglandin E₂）回补部分恢复这些反应。P/G-PLL-IBU保持纳米纤维结构，持续释放布洛芬56天，并显示良好的血液相容性和细胞相容性。在兔中，P/G-PLL-IBU减少早期和长期胶原沉积及上尿路扩张，作用持续至90天。延迟膜置入在治疗后30天观察窗内未产生已建立纤维化的可检测逆转。结论：综上，人类空间图谱与分步体外分析将巨噬细胞活化与输尿管狭窄中成纤维细胞Smad2/3相关重塑联系起来，并且通过静电纺丝膜局部递送布洛芬可削弱输尿管损伤后的这一轨迹。

输尿管狭窄是输尿管损伤后的临床难题，可由医源性操作、热损伤、缺血、结石嵌顿或放疗引起；一旦形成，进行性管腔狭窄会损害尿液引流，并可导致肾积水、反复感染和肾功能丧失。现有球囊扩张、腔内切开、长期支架和重建手术受耐久性不一、操作相关并发症和再干预需求限制，且短期通畅未必转化为长期控制。输尿管狭窄可被视为未消退炎症伴过度细胞外基质沉积的适应不良性创面愈合反应，成纤维细胞和巨噬细胞是核心效应细胞，但常规组织学和批量检测难以界定损伤尿路上皮、巨噬细胞和活化成纤维细胞在同一病灶内的空间共定位，因此需要机制指导的局部治疗。该研究发表于《Materials Today Bio》。研究人员整合人类正常与狭窄输尿管空间转录组学（spatial transcriptomics）与3例狭窄标本来源单细胞RNA测序（scRNA-seq）参考，并以正常输尿管数据集GSE194129独立评估注释；利用输尿管上皮损伤条件培养基（UICM）、原代输尿管成纤维细胞和THP-1衍生巨噬细胞建立上皮-免疫-基质信号模型；构建布洛芬功能化聚己内酯/明胶静电纺丝膜（P/G-PLL-IBU），并在兔输尿管热损伤模型中验证。研究结论为：人类空间图谱揭示狭窄区纤维炎症微环境，体外分步分析连接巨噬细胞活化与成纤维细胞Smad2/3相关重塑，局部布洛芬递送可削弱输尿管损伤后的这一轨迹；早期应用可减轻纤维化和梗阻相关扩张，延迟置入在30天观察窗内未见明显逆转。其意义在于提供空间细胞框架和可局部部署的抗炎生物材料策略，以干预损伤-炎症-纤维化连续过程。

关键技术方法：采用10× Genomics Visium空间转录组（1例狭窄、1例非狭窄）和scRNA-seq（3例狭窄；正常参考GSE194129）分析人输尿管标本（南京医科大学第一附属医院）；分离3例独立供者正常输尿管原代成纤维细胞；以SV-HUC-1来源UICM刺激成纤维细胞和THP-1衍生巨噬细胞，建立序贯条件培养基模型；制备P/G-PLL-IBU膜并进行SEM、接触角、力学、HPLC释放和血液相容性表征；建立兔输尿管热损伤模型，每组每时间点5只，设即时覆盖（7/14/30/90天）和延迟14天置入（44天评估）。

结果部分：空间转录组联合狭窄来源scRNA-seq揭示纤维炎症微环境：以3例狭窄scRNA-seq为参考对空间点注释，发现狭窄区成纤维细胞和髓系程序共富集，COL1A1、POSTN与C1QA、MRC1空间重叠，TGFB1/TGFBR1存在于重塑区；免疫荧光显示CD68阳性巨噬细胞邻近COL1A1阳性成纤维细胞富集区，正常输尿管信号较弱；低正常参考特征点富集肌动蛋白丝过程和细胞骨架组织等。UICM诱导成纤维细胞和巨噬细胞炎症活化：UICM中IL-6、HMGB1和LDH升高；原代成纤维细胞IL1B、IL6、CCL2及IL-6、TNF-α、IL-1β升高，而ACTA2、COL1A1、FN1未显著改变；THP-1巨噬细胞NOS2/iNOS、TNF、IL1B、CD86及炎症因子升高，呈以促炎为主的混合活化。UICM预激活巨噬细胞条件培养基促进iFib促纤维化活化：序贯条件培养基使Fib和iFib的FN1、COL1A1、ACTA2及蛋白和Smad2/3磷酸化升高，以iFib反应最强。可溶性布洛芬和PGE₂回补影响巨噬细胞活化及成纤维细胞条件培养基反应：布洛芬浓度依赖性降低iNOS、CD86、p-p65、COX-2和Arg-1，不表现为简单M1向M2转化；布洛芬处理巨噬细胞条件培养基降低iFib的FN1、COL1A1、α-SMA和Smad2/3磷酸化；PGE₂回补浓度依赖性部分恢复巨噬细胞标志和成纤维细胞反应。P/G-PLL-IBU膜制备与理化表征：通过EDC/NHS将PLL-IBU偶联至PCL/gelatin静电纺膜，SEM显示保持连续纳米纤维，纤维直径增加；接触角、杨氏模量和拉伸强度可比，断裂应变提高；56天质量保持约80%，持续释放布洛芬56天；凝血指标无显著差异、溶血率低、细胞活率高；估计面积载药约19.2 μg/cm²（间接估算）。P/G-PLL-IBU在条件培养基模型中减弱巨噬细胞活化和成纤维细胞反应：膜处理UICM刺激巨噬细胞后降低TNF-α、IL-6、IL-1β及iNOS、CD86、p-p65、COX-2，其条件培养基降低iFib的FN1、COL1A1、α-SMA和Smad2/3磷酸化，空白P/G无显著影响。P/G-PLL-IBU减轻损伤后早期输尿管纤维化和上尿路扩张：兔热损伤即时覆盖后7/14天，P/G-PLL-IBU减少Masson阳性面积和肾盂扩张指数，改善血清AST、ALT、CK、BUN、CREA、LDH；14/30天组织炎症和纤维相关基因/蛋白降低。P/G-PLL-IBU减轻损伤后长期输尿管纤维化和上尿路扩张：30/90天P/G-PLL-IBU减少胶原沉积、保持输尿管结构、降低上尿路扩张，血清指标接近假手术组；主要器官H&E无明显治疗相关异常；90天SEM可见膜衍生纤维存留，但未定量降解率。延迟P/G-PLL-IBU置入在观察窗内未检测到已建立纤维化的逆转：第0天热损伤、第14天置膜、第44天评估，延迟P/G-PLL-IBU未显著降低Masson阳性面积和肾盂扩张指数，血清部分参数较低但仍异常；14天至44天Masson面积增加，30天观察窗内未见已建立纤维化的可检测稳定或逆转，但不能排除更慢或更长期效应。

讨论部分总结：讨论强调在人类组织中空间定义狭窄微环境是概念进展，空间转录组保留组织结构可发现巨噬细胞与成纤维细胞程序共定位，为机械治疗耐久性有限提供组织层面解释；机制上支持成纤维细胞活化的分步模型，即炎症启动与基质生成分化可分离，UICM诱导炎症成纤维细胞样状态，该状态对巨噬细胞条件培养基高度敏感并转向肌成纤维细胞样表型；巨噬细胞作为连接上皮损伤与成纤维细胞命运的上游驱动。布洛芬选择基于其抑制COX依赖前列腺素产生、调节巨噬细胞NF-κB相关信号及与ε-聚-L-赖氨酸偶联的化学兼容性；实验中布洛芬降低p-p65、COX-2、iNOS、CD86、炎症介质和Arg-1，提示其削弱UICM诱导的混合活化而非促进经典M2极化；PGE₂回补部分恢复巨噬细胞和成纤维细胞反应，提示实验系统存在PGE₂反应成分且其生物学具背景依赖性。递送策略方面，静电纺丝膜可贴合组织表面、模拟ECM样结构并持续释放，体外复现可溶性布洛芬的通路效应；兔即时覆盖获益最明显，延迟14天置入在30天观察窗内未见明确逆转，提示早期局部抗炎干预更有利。局限性包括：3例狭窄标本参考样本量有限及跨数据集差异；UICM成分复杂；未与其他NSAIDs头对头比较；功能化膜初始布洛芬总量未直接定量；条件培养基实验未排除残留布洛芬或PGE₂对成纤维细胞的直接作用；延迟覆盖组仅观察30天。研究结论翻译：总之，本研究建立了人类输尿管狭窄的空间分辨细胞图谱，并强调巨噬细胞-成纤维细胞轴，其中上皮损伤与Smad2/3相关促纤维化重塑相连。研究人员进一步开发了能够持续释放布洛芬的静电纺丝膜，并证明该支架局部递送可抑制巨噬细胞炎症活化，并降低暴露于处理巨噬细胞条件培养基的成纤维细胞的促纤维化反应，且在损伤后早期应用时具有体内获益。总之，将人类空间转录组学与机制指导的生物材料相结合，支持一种可操作的策略，以局部干预驱动输尿管狭窄的损伤-炎症-纤维化连续过程。