基于cox2基因的林业疫霉多物种同步检测：快速田间方法与多重实时荧光PCR技术的开发

《Forest Pathology》：Development of a Rapid, Field-Based Method and a Real-Time Multiplex PCR for Simultaneous Detection of Multiple Forestry Phytophthora Species

　　

目前有若干疫霉属（Phytophthora）物种对林业构成重大威胁。其中三种物种：P. pluvialis、P. pseudosyringae 和 P. ramorum 在不列颠群岛具有相似寄主范围，并表现出相似的症状和病程进展。由于 P. pluvialis 和 P. ramorum 在英国属于管制性病原体，早期准确检测对于这些潜在入侵性和高度破坏性病原体的适当管理至关重要。研究人员开发了两种诊断检测方法，均靶向线粒体基因细胞色素c氧化酶亚基II（cox2）：一种多重实时荧光聚合酶链式反应（RT-PCR），能够同时检测这三种疫霉属物种；以及一种等温重组酶聚合酶扩增（RPA）检测法，用于检测 P. ramorum 和 P. pluvialis。该RT-PCR方法具有高度特异性和敏感性，检测限（LOD）范围为7.4至36 fg菌丝体DNA，适用于受感染植物材料的检测，诊断准确率>90%。RPA方法可在采样现场使用，并在20分钟内提供结果。该检测法表现出高特异性，LOD在1至10 pg菌丝体DNA之间，具体取决于物种和谱系。尽管敏感性低于RT-PCR检测法，但这种快速、一线检测方法适用于植物基质，可从RT-PCR阳性<30个循环的样本中获得阳性检测结果。这些新的诊断工具提高了检测的准确性和速度，在不影响敏感性的前提下降低了成本。RPA检测法可在田间、边境和港口提供快速结果，并能有效对实验室分析样本进行分流。

论文解读文章

一、研究背景与目的

疫霉属（Phytophthora）物种是植物健康面临的最重大威胁之一，迄今已有至少253个物种和杂交种被正式描述。作为破坏性极强的植物病原体，它们对本土生态系统、农业和林业构成重大风险。许多疫霉属物种寄主范围广，与土壤、水或空气相关，可引起严重的根部、茎部和叶部病害，导致植物衰退和死亡。

在英国，三种疫霉属物种——P. pluvialis、P. pseudosyringae 和 P. ramorum——频繁在多种经济和生态上重要的针叶树上被检出。三者均与落叶松的衰退和死亡有关，而 P. pluvialis 和 P. ramorum 还影响西部铁杉和花旗松。P. pluvialis 和 P. ramorum 在英国均被列为管制性病原体，检出后需要立即采取补救措施。相比之下，P. pseudosyringae 被认为是欧洲本土物种，尽管其产生类似的衰退症状，但由其引起的病害暴发不受法律管理规定的约束。因此，早期准确检测对于有效管理这些高破坏性病原体至关重要。

分离疫霉属物种，尤其是 P. pluvialis，既具挑战性又耗时。因此，可靠的分子检测方法对于有效监测这些病原体必不可少。目前已开发多种分子检测技术，包括针对 P. pluvialis 和 P. ramorum 的特异性RT-PCR检测法。然而，现有的实时PCR方法在多重检测寄主重叠的林业相关物种组合方面能力有限，或在与靶向ITS区域的检测法中表现出与非靶标疫霉属物种的交叉反应。快速田间检测方法如卵菌侧向流动装置（LFDs）虽能提供快速结果，但无法区分疫霉属与卵菌纲内其他属（如腐霉属 Pythium），可能导致假阳性，且无法鉴定到物种水平。等温扩增方法如环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）为田间检测提供了更高的特异性。目前对样本进行 P. pluvialis、P. pseudosyringae 和 P. ramorum 检测需分别进行三项独立测试，效率低、成本高且耗时。本研究旨在通过开发一种高特异性和高敏感性的实验室多重实时荧光PCR检测法，同时检测这三种物种，并开发一种基于田间的RPA检测法，在采样现场确认植物材料中 P. ramorum 或 P. pluvialis 感染的存在与否。

二、研究内容与结论

研究人员开发了两种新的诊断方法。第一种是高敏感性和特异性的TaqMan实时PCR多重检测法，能够同时检测与英国、欧洲和北美植物健康相关的三种疫霉属物种，这些物种存在寄主重叠。该方法相比以往需要运行两次独立实时PCR并辅以Sanger测序的检测方法，提高了诊断速度和效率，降低了成本。第二种是两种新的等温RPA检测法，用于 P. ramorum 和 P. pluvialis 的快速便携检测。该过程涉及冻干、易用的试剂盒和电池供电的荧光读取设备，可在田间、边境和港口使用，20分钟内即可解读结果。这是已知首次为 P. pluvialis 开发的此类检测方法。这些检测方法还可轻松适配侧向流动输出形式。

三、关键技术方法

研究人员以线粒体基因细胞色素c氧化酶亚基II（cox2）为靶标，基于已有的 P. pluvialis 高灵敏检测法进行引物/探针设计。从Genbank或注释的线粒体基因组和全基因组序列中获取202条cox2序列，在Geneious Prime中进行比对，选择150至384 bp区域设计物种特异性引物和探针。P. pluvialis、P. ramorum 和 P. pseudosyringae 的水解探针分别在5′端标记FAM、HEX和TEXAS RED荧光染料，并采用内部ZEN和3′端Iowa Black FQ双重淬灭。另设一组靶向18S核糖体DNA的通用引物/探针作为DNA质量内部对照，以Cy5标记。RPA引物和探针根据TwistAmp DNA扩增试剂盒检测设计手册手动设计，采用TwistAmp exo探针。测试材料来自英国Forest Research Alice Holt研究站和Fera Science Ltd.的培养物保藏，分离自英国有害生物和病原体监测活动中送检的自然感染植物材料。外部验证在Fera Science Ltd.第二实验室进行，使用不同仪器和操作人员。

四、研究结果

4.1 检测方法优化

多重RT-PCR的最佳退火温度确定为63°C。低于此温度会产生与其他clade three疫霉属物种的非特异性扩增，高于此温度（65°C）则对 P. pseudosyringae 靶标的扩增产生负面影响。在低浓度18S引物和探针条件下，P. pluvialis 在单重与多重检测中的C_t值无显著差异。P. ramorum 在多重检测中的C_t值比单重低约3.5个循环，差异显著。P. pseudosyringae 在两种检测方式中的C_t值差异不到一个循环。

4.2 引物/探针特异性

多重RT-PCR检测法表现出高水平的物种包容性，所有靶标物种的分离株均被相应引物/探针组成功检出，三种物种间无非靶标通道交叉反应。排他性也很高，测试了clade one至eight的大量疫霉属物种及多个腐霉属分离株。P. pseudosyringae 引物和探针与七个 P. ilicis 分离株中的三个存在交叉反应，其中两个为晚期阳性（C_t 33.58±2和35±0），一个产生C_t值30.14±0.5。但来自Fera Science的 P. ilicis 分离株均未产生交叉扩增。在第二实验室的特异性测试中发现 P. pluvialis 通道有两个晚期阳性反应，分别来自 P. alni、P. cryptogea、P. ilicis、P. kernoviae 和 P. syringae 菌丝体DNA各一个重复，但均在35个循环之后且仅在一个孔中出现，不会被判定为阳性。P. ramorum RPA检测法检出了全部13个 P. ramorum 分离株，两个欧洲谱系的TTP值相似。在15个其他疫霉属和腐霉属分离株的排他性测试中，有两个晚期交叉反应（P. hibernalis 和 P. lateralis），均在反应最后2分钟内产生TTP结果。

4.3 PCR效率与敏感性

RT-PCR反应中，所有标准曲线均表现出强线性相关性（平均R2>0.9950），回归曲线斜率在?3.342至?3.607之间。P. pluvialis 的PCR效率为99.17%，P. ramorum EU1为93.95%，P. ramorum EU2为89.88%，P. pseudosyringae 为89.34%。三种靶标物种的检测限（LOD）分别为：P. pluvialis 6 fg靶标DNA（C_t=33.71±0.36），P. ramorum EU1 10.4 fg（C_t=35.00±0.00），P. ramorum EU2 16.4 fg（C_t=34.56±0.63），P. pseudosyringae 25.8 fg（C_t=34.56±0.63）。第二实验室测试的分离株LOD约为Forest Research测试分离株的100倍，P. ramorum 和 P. pluvialis 均为100 fg，P. pseudosyringae 为1 pg。第二实验室两台仪器的平均PCR效率较低，P. pluvialis 为73%，P. ramorum 为75%，P. pseudosyringae 为63%。

4.4 感染植物材料检测

RT-PCR检测法成功从接种树苗的树皮样本中检出 P. ramorum（C_t=19.97±0.8）和 P. pseudosyringae（C_t=22.10±2.5）的双重感染，仅一个样本未检出 P. ramorum，两个样本未检出 P. pseudosyringae，但经其他方法确认后结果一致，可能为接种失败所致。两个样本含极低浓度 P. pluvialis，仍可与其他两种物种同时检出，平均C_t值32.65±1.7。全部20个加标样本均检出三种靶标，平均C_t值分别为 P. pluvialis 31.84±2.4、P. ramorum 27.88±1.3和 P. pseudosyringae 24.40±1.5，表明多重检测中无偏好性扩增的不利影响。55个样本全部正确检出靶标，诊断特异性100%，诊断敏感性97.8%，仅一个 P. pluvialis 假阴性。检测性能不受寄主物种或基质差异影响。

4.5 与现有方法比较

与O'Neill等人（2025）的 P. pluvialis RT-PCR检测法相比，本研究的引物/探针组在14个测试样本中表现相似，对感染植物材料的敏感性略高，多重检测平均C_t=28.59±10.2，比O'Neill等人的29.95±10.2低约一个循环。与Hughes等人（2006）的 P. ramorum RT-PCR检测法相比，两种检测法总体敏感性相似，EU1谱系样本在本检测法中平均C_t=22.94±5.9，比Hughes等人的23.83±5.8高约一个循环。EU2样本敏感性差异不到一个循环。本检测法无非靶标扩增，但Hughes等人的检测法对 P. lateralis（平均C_t=29.73±1.3）和 P. pseudosyringae（平均C_t=35.00±0.0）存在交叉反应。与其他已发表的 P. ramorum RT-PCR检测方案相比，本研究开发的检测法特异性或敏感性相似或更高。

4.6 重复性

12次重复中三种靶标物种的检出率均为100%，即使在LOD浓度下也是如此。相对标准偏差（变异系数）所有靶标均低于1.5%，包括LOD浓度（去除 P. ramorum 10^?1稀释度的一个异常结果后）。

4.7 重现性

第二实验室中，不同仪器间的C_t值一致，CFX96系统平均C_t=33.60±3.6，QuantStudio 7系统平均C_t=34.63±2.1，无显著差异。操作人员差异也很小，用户一平均C_t=33.49±3.9，用户二平均C_t=34.17±2.8，无显著差异。实验室间比较显示阳性/阴性判定一致性为88.9%，第二实验室将一个阳性样本判定为阴性。第二实验室获得的C_t值平均比Forest Research高约5个循环（30.01±1.9对比25.47±3.0），表明相同实验室条件下该检测法敏感性较低。

4.8 RPA检测法优化与性能

P. pluvialis RPA检测法成功检出5个 P. pluvialis 分离株的DNA。排他性总体较高，38个测试分离株中仅有3个交叉反应（一个 P. alni 和两个 P. cambivora 分离株）。P. pluvialis RPA检测法的分析敏感性在10^?1至10^?4（0.1 ng至0.1 pg）十倍稀释系列中测试，三个分离株均可检出至10 pg靶标DNA浓度，TTP范围为09:00至11:15（mm:ss）。P. ramorum RPA检测法在10^?4稀释度下EU2分离株100%重复检出，但EU2分离株仅50%–75%重复检出。EU2分离株在10^?3稀释度下100%检出。EU1和EU2分离株的平均LOD浓度分别为0.5 pg±0.1和6.0 pg±4.7，EU2谱系敏感性较低。P. ramorum RPA检测法的重复性总体较高，EU1在10次LOD重复中检出率100%，EU2相同稀释度下检出率60%且TTP较晚。P. pluvialis RPA检测法的诊断特异性和敏感性均为100%，9个自然感染样本全部正确判定。P. ramorum RPA检测法的诊断特异性和敏感性也为100%，17个样本全部正确判定。冻干试剂盒与液体试剂盒在24种不同样本类型中表现相似，一致性95.8%。冻干试剂盒敏感性较高（平均TTP：12.34±3.58 mm:ss），液体试剂盒平均TTP为13.99±4.38 mm:ss，差异不显著。两个 P. lateralis 菌丝体DNA非靶标在两种试剂盒中均产生阳性反应，而此前特异性测试中 P. lateralis 为阴性结果。

五、讨论总结

与以往方法相比，新的多重RT-PCR检测法对 P. pluvialis 和 P. ramorum 的敏感性相似或略高，并减少了Forest Research实验室目前使用的Hughes等人（2006）检测法中观察到的非特异性扩增。为避免二级结构，研究人员使用cox2设计了一套新的 P. pluvialis 引物/探针组，该基因已被证明是实时PCR的高度合适候选基因。多重RT-PCR检测法表现出高特异性，P. pluvialis 或 P. ramorum 通道的交叉反应均出现在C_t>35且仅在一个重复中，不会被判定为阳性。唯一值得注意的是 P. pseudosyringae 通道与 P. ilicis 分离株的交叉反应。P. ilicis 对冬青属（Ilex spp.）具有寄主特异性，因此检测其他寄主时不应成为问题，但应考虑寄主范围扩展的可能性。多重检测中18S内部对照在不同实验室间存在敏感性差异，可能源于不同RT-PCR仪器的光谱敏感性差异。多重检测中同时检测多种病原体而不损失敏感性很重要，因为竞争靶标可能消耗Taq聚合酶，偏好性扩增可能扭曲结果。三种靶标均在多个样本中成功检出，包括低水平 P. pluvialis 感染的样本，表明其敏感性未受其他两种物种扩增的影响。实验室间比较发现的局限性在于，在不同仪器和实验室环境中使用多重RT-PCR时，应针对这些仪器进行优化，以确保敏感性不损失，特别是在检测低丰度靶标与高丰度靶标组合时。总体而言，多重RT-PCR检测法高度敏感和特异，能够可靠识别感染 P. pluvialis、P. ramorum 和/或 P. pseudosyringae 的症状性坏死树皮样本，并可检测已在落叶松中记录的共感染。对于田间检测，RPA表现出相对较高的特异性和敏感性。P. ramorum RPA的LOD对EU1比最近发表的LAMP检测法敏感600倍，对EU2谱系敏感50倍。RPA检测法在采样现场使用的可能限制是获得足够高产量和质量的植物材料DNA，但已有针对 P. ramorum 的田间DNA提取方法，DNA产量为10–100 pg/μL，在RPA检测法的LOD（1至10 pg）范围内可检出。

六、研究结论

研究人员开发了两种有用的新诊断工具，可用于区分三种在不列颠群岛引起相似视觉症状且寄主范围重叠的疫霉属物种（P. pluvialis、P. pseudosyringae 和 P. ramorum）。多重RT-PCR可实现敏感且同步的检测，减少诊断的总体时间和成本。为 P. pluvialis 和 P. ramorum 开发的RPA检测法可在采样现场提供快速检测，适用于需要快速周转的情况，或作为实验室分析前排除其他非管制疫霉属物种的有效分流手段。