《European Journal of Lipid Science and Technology》：From Hypothesis to Experimental Evidence: Reversibility of Fatty Acid Hydratases Exemplified for Dehydration of (S,Z)-13-Hydroxyoctadec-9-enoic Acid
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虽然亚油酸水合酶来自嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）的自然反应是在亚油酸水合作用下生成(S,Z)-13-羟基-9-十八碳烯酸（(S,Z)-13-hydroxyoctadec-9-enoic acid），但本研究证明该酶同样能够催
虽然亚油酸水合酶来自嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）的自然反应是在亚油酸水合作用下生成(S,Z)-13-羟基-9-十八碳烯酸（(S,Z)-13-hydroxyoctadec-9-enoic acid），但本研究证明该酶同样能够催化逆向反应即脱水反应。在热力学控制下，当底物浓度为20 mM时，该生物转化达到平衡状态，(S,Z)-13-羟基-9-十八碳烯酸与亚油酸的比例约为80:20。因此，本工作进一步证明了脂肪酸水合酶（fatty acid hydratases）也能催化脂肪酸衍生仲醇的脱水反应。除了对理解该类酶以及解释不饱和脂肪酸生物催化水合反应不完全转化的现象具有基础意义外，这些结果还为一种新颖化学开辟了前景，即在室温水相中利用脂肪酸脱水酶将多种（脂肪族）仲醇转化为烯烃。
研究背景与科学问题
不饱和脂肪酸的水合反应近年来受到广泛关注，被视为获取羟基脂肪酸（hydroxy fatty acids）的重要途径。这类羟基脂肪酸可作为生物基单体用于构建聚酯等高分子材料，其原料来源于廉价易得的植物油资源如高油酸葵花籽油或亚麻籽油中的油酸和亚油酸。脂肪酸水合酶（fatty acid hydratase）是高效催化此类反应的生物催化剂，目前尚未发现能在温和条件及选择性方面与之竞争的化学催化剂。然而，尽管应用前景广阔，该生物转化过程普遍存在转化率不完全的问题，严重制约了工业化大规模应用。研究人员提出两个关键科学问题：一是不完全转化的原因是什么；二是这种水合反应是否本质上是一个可逆反应，若如此，在水相反应介质中可逆程度如何。此前已有学者假设过该反应的可逆性，但仅有Ogawa等人在2016年报道了一个实验案例，证明来自植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的亚油酸水合酶可催化10-羟基-顺式-12-十八碳烯酸脱水生成亚油酸，转化率约20%。
研究内容与结论
为寻找更多实验证据证明此类平衡的存在，并验证脂肪酸水合酶普遍具有可逆性的假说，研究人员选用来自嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）的亚油酸水合酶（linoleic acid hydratase from L. acidophilus，简称LaLhy）作为重组生物催化剂进行研究。研究人员首先通过制备规模生物转化合成了纯度高>99%的底物(S,Z)-13-羟基-9-十八碳烯酸。随后，分别从正向水合反应和逆向脱水反应两个方向进行动力学研究，证实该反应受热力学控制，在20 mM底物浓度下达到平衡时，羟基脂肪酸与亚油酸的比例约为85:15。这一发现不仅解释了文献中水合反应转化率无法达到完全的原因，还揭示了脂肪酸水合酶在温和条件下（近室温、水相）催化仲醇脱水的巨大潜力，且反应具有优异的区域选择性和立体选择性。
关键技术与方法
研究人员采用的主要关键技术包括：核磁共振波谱法（NMR spectroscopy）和气相色谱法（GC）对反应产物进行定性与定量分析；利用柱色谱法（C-18反相柱，乙腈-水梯度洗脱体系含1%乙酸）纯化目标产物；在大肠杆菌BL21（DE3）中异源表达LaLhy重组蛋白并通过SDS-PAGE确认过表达；以冻融处理后的全细胞（whole cells）作为生物催化剂配方进行生物转化实验。
研究结果
2.5 亚油酸水合动力学
研究人员在35°C、850 rpm条件下，以20 mM亚油酸为底物，利用含LaLhy过表达的重组大肠杆菌BL21（DE3）全细胞（湿重100 mg/mL）进行水合反应。结果表明，反应在8小时后转化率达到约82%-85%，此后趋于平稳，说明反应接近热力学平衡。
2.6 化合物2的脱水实验
研究人员将纯度>99%的(S,Z)-13-羟基-9-十八碳烯酸与含LaLhy的全细胞催化剂在相同条件下反应20小时，观察到亚油酸的生成，转化率为12%。阴性对照实验（使用空载体pET28a的大肠杆菌全细胞或不加任何生物量）均未检测到产物形成，证实脱水反应由LaLhy特异性催化。
2.7 脱水反应动力学
延长反应时间至24小时的动力学研究表明，脱水反应在前2小时内快速达到约12%的转化率，随后在8小时后达到约15%的平台期，与水合反应达到的平衡状态高度一致。
讨论与结论
研究人员指出，本研究证实的可逆性很好地解释了为何在不饱和脂肪酸水合工业应用中难以实现极高转化率（>90%）的问题。值得注意的是，当底物浓度显著高于溶解度极限时，大量不溶性产物相的形成可能影响热力学平衡，从而在某些情况下实现>90%的转化率。此外，与传统有机合成中需要在强酸和>100°C高温条件下才能实现的醇脱水反应相比，酶促脱水在近室温水相中进行，且具有传统化学催化无法比拟的优异区域选择性和立体选择性——只生成9,12-二烯产物（亚油酸），未观察到反式异构体或其他位置异构副产物。
研究结论：本研究证明了嗜酸乳杆菌亚油酸水合酶的催化可逆性，即该酶既能催化亚油酸水合，也能催化(S,Z)-13-羟基-9-十八碳烯酸的逆向脱水反应。在热力学控制下，20 mM底物浓度时的平衡比例为(S,Z)-13-羟基-9-十八碳烯酸与亚油酸约85:15。本工作提供了脂肪酸水合酶也能催化脂肪酸衍生仲醇脱水的进一步证据。除对该酶类的基础理解和解释生物催化脂肪酸水合反应不完全转化具有重要意义外，研究结果为一种新颖化学开辟了前景，即在室温水相中利用脂肪酸脱水酶在区域和立体选择性控制下将多种（脂肪族）仲醇转化为烯烃。未来的研究方向包括考察底物浓度对脱水反应程度的影响、开发推动反应向脱水方向进行的策略，以及深入理解涉及活性位点水分子作用及其扩散机制的催化机理。
