Ghiorsea bivora外膜细胞色素Cyc2TAG1_1的异源生产、纯化及铁氧化动力学与氧化还原特性表征

《FEBS Open Bio》：Characterization of the key membrane protein cytochrome Cyc2 from Ghiorsea bivora

　　

本研究报道来自Ghiorsea bivora TAG1的细胞色素Cyc2_TAG1 cluster 1（Cyc2_{TAG1_1}）在大肠杆菌BL21外膜中的异源生产、纯化与表征。利用特定基因构建体，研究人员优化了增溶与纯化方案，以获得高纯度酶。这使通过电子顺磁共振（EPR）进行生物物理表征、测定其中点氧化还原电位，以及开发以2,6-二氯酚靛酚（DCPIP）为人工终电子受体的铁氧化测定成为可能。该研究提供了Cyc2同源物的首个体外定量动力学表征。文献中缺乏与天然或人工电子受体可比的表观Km或Vmax值，凸显了研究结果的新颖性。Cyc2_{TAG1_1}对硫酸铁的表观Km为627 ± 226 μm，与G. bivora栖息的富铁热液喷口环境一致；表观Vmax为19 ± 5 μm·s^?1。尽管所用人工电子受体不能准确代表天然伙伴或真实能量系统，该酶仍表现出具有生物学意义的表观动力学参数，其催化效率处于功能性电子转移酶的预期范围内。Cyc2_{TAG1_1}相对于标准氢电极（SHE）的氧化还原电位为?130 ± 20 mV，为Cyc2同源物中报道的最低值。EPR谱与蛋白桶内具有两个轴向配体的低自旋高铁血红素一致。这些发现提供了Cyc2_{TAG1_1}的首个生化表征，并支持其推定的铁氧化作用。

研究背景与目的：海洋中铁调控初级生产力和碳循环，是浮游植物呼吸、固氮和光合作用必需微量营养盐；海水中铁主要以可溶性较高的Fe(II)和溶解度较低的Fe(III)存在，Fe(II)在含氧表层水可非生物氧化为Fe(III)并形成铁氧氢氧化物沉淀。除化学氧化外，微需氧亚铁氧化细菌（FeOB, ferrous iron-oxidizing bacteria）等进行的生物铁氧化是古老且持续的代谢。海洋FeOB多归于Zetaproteobacteria（ζ-变形菌纲），其在近中性pH和低氧下以铁氧化获能并形成富铁微生物席。G. bivora（TAG-1和SV-108）分离自中大西洋脊Trans-Atlantic Geotraverse（TAG）热液区富铁微生物席，可利用Fe(II)或H₂生长，是目前ZetaOTU9唯一培养代表，分布于富铁深海生境。FeOB电子传递链中，外膜c型细胞色素Cyc2被认为是Fe(II)氧化起始酶；A. ferrooxidans Cyc2被体外验证，Keffer et al.验证了M. ferrooxydans PV-1的Cyc2_PV-1 cluster 1铁氧化活性并测得pH 8氧化还原电位+208 ± 20 mV vs SHE（standard hydrogen electrode，标准氢电极）。G. bivora TAG1有两个Cyc2拷贝，分属cluster 1和3，但二者铁氧化活性及差异效率尚未证实，cluster 1缺乏生化表征和动力学参数。因此研究人员以Cyc2_{TAG1_1}为对象，开展异源生产、纯化、结构预测、EPR、氧化还原电位和DCPIP铁氧化动力学表征，以理解其在富铁海洋FeOB呼吸链中的铁氧化酶作用。

研究开展、结论与意义：研究人员在大肠杆菌BL21外膜中异源生产G. bivora Cyc2_{TAG1_1}，优化增溶和纯化获得高纯度酶，并用EPR（electron paramagnetic resonance，电子顺磁共振）、氧化还原滴定和以DCPIP（2,6-dichlorophenolindophenol，2,6-二氯酚靛酚）为人工终电子受体的铁氧化测定进行表征。研究给出Cyc2_{TAG1_1}对硫酸铁的表观Km 627 ± 226 μm、表观Vmax 19 ± 5 μm·s^?1，为Cyc2同源物首个体外定量动力学；表观kcat 633 ± 167 s^?1，比活905 ± 238 μmol·min^?1·mg^?1，催化效率约1.0×10⁶ m^?1·s^?1。其氧化还原电位?130 ± 20 mV vs SHE为已报道Cyc2同源物最低；EPR谱符合蛋白桶内两个轴向配体的低自旋高铁血红素。结论支持其推定铁氧化作用，为理解G. bivora及海洋FeOB铁氧化提供生化基础，并揭示Cyc2同源物氧化还原多样性。

关键技术方法：研究以G. bivora TAG1的cyc2_TAG1（WP_038247608.1；NCBI accession JQLW00000000）为来源，将天然信号序列替换为E. coli ompA信号肽，并在3′端加入TEV位点、连接区和7-His标签；与携带ccm（cytochrome c maturation，细胞色素c成熟）基因的pEC86共转化E. coli BL21(DE3)。差速离心富集OM（outer membrane，外膜），NLS（N-lauroylsarcosine，N-月桂酰肌氨酸）增溶，Ni-NTA（nickel-nitrilotriacetic acid，镍-次氮基三乙酸）纯化，去垢剂交换为DDM（N-dodecyl-β-D-maltoside，N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷）。用SDS/PAGE与TMBZ（3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine）血红素染色及质谱鉴定；厌氧DCPIP还原法测动力学，化学滴定测氧化还原电位，EPR测血红素配位，AlphaFold 3和PPM 3.0作结构预测。无临床样本队列，来源为TAG1基因序列。

研究结果：1）结构预测：通过AlphaFold 3预测，Cyc2_{TAG1_1}呈β-桶拓扑，由16条反平行β-链组成圆柱结构，N端融合含保守CXXCH基序的血红素c结构域；PPM 3.0预测其疏水厚度23.5 ± 1.1 ?、倾角2° ± 1°，β-桶嵌入膜脂；蛋白内预测有约20 ?深×20 ?直径的环状腔，内侧朝向血红素结合口袋呈酸性表面。2）Cyc2_{TAG1_1}异源生产与纯化：通过TMBZ血红素染色和SDS/PAGE，在E. coli BL21中检测到约45 kDa全蛋白；经NLS增溶、Ni-NTA纯化和DDM交换，目标蛋白纯度约93%，产量约68 μg·L^?1培养物；纯化蛋白Soret峰408 nm，连二亚硫酸钠还原后移至418 nm并出现524 nm和552 nm峰，符合低自旋c型细胞色素；铁氰化钾不改变光谱，说明制备态为氧化态。3）体外细胞色素Cyc2_{TAG1_1}铁氧化酶活性的验证与表征：通过厌氧DCPIP还原测定，Fe(II)+DCPIP对照有缓慢化学还原，加入Cyc2_{TAG1_1}使初速增加约两倍；Cyc2_{TAG1_1}单独与DCPIP不还原；Michaelis–Menten非线性回归得表观Km 627 ± 226 μm、Vmax 19 ± 5 μm·s^?1、kcat 633 ± 167 s^?1、比活905 ± 238 μmol·min^?1·mg^?1，催化效率1.0×10⁶ m^?1·s^?1。4）Cyc2_{TAG1_1}的氧化还原电位：通过pH 7化学滴定监测418–430 nm吸收变化，Nernst n=1拟合得Em=?130 ± 20 mV vs SHE。5）EPR：通过15 K X波段EPR，纯化Cyc2_{TAG1_1}与外膜富集均显示gz=2.94、gy=2.25低自旋血红素c信号，提示两个轴向配体为组氨酸或甲硫氨酸；弱g=2.0和g=4.3信号归因于次要顺磁物种或痕量高铁杂质；两者谱可叠加，说明观测特征为Cyc2_{TAG1_1}固有。

讨论部分总结：研究人员指出本研究首次对Cyc2同源物进行定量动力学表征；与Keffer et al.相同的基因构建相比，纯化方案改进降低了污染，避免高蔗糖增溶对透析和活性测定的影响。DCPIP为人工电子受体，FeSO₄为可溶Fe(II)源；表观Km 627 ± 226 μm与A. ferrooxidans铁:rusticyanin氧化还原酶约300 μm处于同一范围，Vmax显示加速Fe(II)向DCPIP的电子转移；动力学参数变异可能受去垢剂、厌氧操作和手动混合影响。Km与TAG喷口3800–5000 μm、Lucky Strike 70–2800 μm、F?vne可达20 mm等富铁热液环境Fe(II)浓度范围相容，而开放海洋可低至约0.1 nm，预期限制活性。Cyc2_{TAG1_1}的?130 ± 20 mV vs SHE为Cyc2同源物最低，明显低于Cyc2_PV-1的+208 ± 20 mV和A. ferrooxidans Cyc2的+560 mV（pH 4.8）至约700 mV（pH 2），但落在S. lithotrophicus MtoA的+100至?400 mV范围内，原文提出低电位血红素可与Fe(II)氧化兼容，并认为需进一步比较生物物理和结构研究；G. bivora铁生长时胞外代谢物可显著抑制Fe(II)非生物氧化，使Fe(II)半衰期由约3天增至约335天。

研究结论翻译：总之，本研究为Cyc2_{TAG1_1}的生化表征提供了第一步；从E. coli外膜重组生产与纯化Cyc2_{TAG1_1}，使研究人员能够评估其Fe(II)氧化活性、测定表观催化参数，并通过EPR光谱和氧化还原电位测定阐明其光谱与氧化还原性质。这些结果为Cyc2_{TAG1_1}催化特性提供新见解，支持其在FeOB Fe(II)氧化中的推定作用，并为未来鉴定其天然氧化还原伙伴及在更生理相关条件下表征其活性奠定基础。