基于氯化胆碱:尿素天然低共熔溶剂的藜麦籽粒可持续蛋白提取及MALDI-TOF-MS完整蛋白谱分析

《Microchemical Journal》：Development of a sustainable protein extraction method from quinoa grains using natural deep eutectic solvents and MALDI-TOF-MS intact protein profiling

　　

研究人员合成并评价了氯化胆碱:尿素（ChCl:urea）天然低共熔溶剂（natural deep eutectic solvents, NADES）用于藜麦蛋白的绿色提取。NADES 2（1:1）表现出最有利的理化性质和蛋白回收。采用MALDIquant的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）检测到39个蛋白峰，其中27个经初步鉴定。NADES与传统提取表现出互补选择性。采用蛋白进化关系分析（Protein Analysis Through Evolutionary Relationships, PANTHER）对鉴定蛋白在主要基因本体（Gene Ontology, GO）域中进行归类。

Morgana Neuls-Mayer、Rocío Galindo-Luján、Laura Pont与Fernando Benavente围绕藜麦籽粒蛋白的绿色提取及完整蛋白谱分析开展研究。研究背景方面，藜麦（Chenopodium quinoa Willd.）为安第斯地区传统高营养谷物，因无麸质、必需氨基酸组成较均衡及含植物化学物而受到全球关注；其蛋白提取传统上依赖有机溶剂和极端pH条件。现有碱法提取虽直接，但pH>10可引起蛋白二级、三级和四级结构不可逆改变，促进多酚氧化和赖氨酸丙氨酸形成，降低蛋白消化性并消耗必需氨基酸，且酸中和后产生废水；因此需要发展符合绿色化学原则、减少溶剂消耗和提取时间的替代方法。天然低共熔溶剂（NADES；由天然氢键受体和供体形成的低共熔混合物）因可生物降解、易制备、可调黏度和溶解能力而成为候选绿色溶剂，其中氯化胆碱（ChCl）与尿素形成的ChCl:urea NADES在食品蛋白提取中受到关注。该研究旨在以碱性ChCl:urea NADES替代传统蛋白提取（conventional protein extraction, CPE），表征溶剂理化性质，并比较藜麦蛋白提取物总蛋白含量及MALDI-TOF-MS完整蛋白谱，进而通过PANTHER-GO进行功能分类。

关键技术方法概括：研究人员以西班牙巴塞罗那当地超市购买的玻利维亚白藜麦商品籽粒为样本，经研磨和干燥后提取。合成ChCl:urea NADES 1（1:2）、NADES 2（1:1）和NADES 3（2:1，含15%水），测定表观pH、密度、电导率（electrical conductivity, EC）、黏度、折光率和极性，并以衰减全反射傅里叶变换红外光谱（attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR-ATR）确认氢键网络。蛋白提取采用NADES溶解、乙酸沉淀至pH 5.0、硼酸盐缓冲液复溶，并以磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS）作复溶对照，以液相色谱-紫外检测（liquid chromatography-ultraviolet detection, LC-UV）辅助比较。提取物脱盐后行MALDI-TOF-MS正离子中、高质量检测，采用MALDIquant预处理和峰检测，并与已发表藜麦籽粒鸟枪液相色谱-串联质谱（shotgun LC-MS/MS）蛋白组图比对初步鉴定；鉴定蛋白经基本局部比对搜索工具（BLAST）映射至拟南芥后行PANTHER-GO分类。

研究结果方面，3.1 NADES选择与表征（NADES selection and characterization）：通过合成不同摩尔比ChCl:urea NADES并比较其用于白藜麦蛋白提取的表现，研究人员发现NADES 1和NADES 2提供较有代表性和分辨良好的蛋白谱，NADES 3峰强度较低、谱图复杂度较低；结合试剂消耗和谱图表现，NADES 2被选用于后续蛋白鉴定及与CPE比较。高亮信息指出NADES 2（1:1）具有最有利的理化性质与蛋白回收。3.1.1 理化性质（Physicochemical properties）：通过测定表观pH、密度、EC、黏度、折光率和极性，得出三种NADES表观pH约为8.6–9.0，NADES 3具有最高EC、最低黏度、较低pH和折光率，而三种体系极性相近（约50.4 kcal mol^?1）；NADES 3较低表观pH和较高EC可能与其较低蛋白提取效率有关。3.1.2 FTIR：通过FTIR-ATR比较纯组分与NADES，观察到尿素NH₂伸缩振动由3430 cm^?1和3359 cm^?1移至3422 cm^?1和3330 cm^?1并增宽，3197 cm^?1附近出现OH与NH重叠宽峰，说明ChCl与尿素间形成较强氢键网络并确认低共熔结构形成；不同摩尔比及少量水主要影响谱带强度。3.2 蛋白提取（Protein extraction）：通过NADES溶解、pH 5.0异电沉淀及硼酸盐缓冲液复溶，并比较PBS复溶，得出硼酸盐缓冲液复溶较快、回收略高（NADES 2为19 mg，PBS为14.6 mg），LC-UV蛋白信号也略高，因此选择硼酸盐缓冲液作为复溶介质。3.3 MALDI-TOF-MS分析（MALDI-TOF-MS analysis）：通过正离子模式在中质量5500–25,000 m/z和高质量25,000–60,000 m/z获取谱图，得出NADES与CPE蛋白谱总体可比；NADES 1和NADES 2谱图信噪比、峰分辨和信号分布较佳，NADES 3提取效率较低；基于试剂消耗选择NADES 2与CPE进一步比较。3.4 MALDIquant质谱预处理与峰检测（Mass spectra preprocessing and peak detection using MALDIquant）：通过MALDIquant进行方差稳定、平滑、基线校正、归一化、对齐和峰合并，在NADES 2与CPE提取物中共检测39个蛋白峰，其中27个经与藜麦籽粒蛋白组图比对初步鉴定；NADES 2检测20个峰，CPE检测27个峰，NADES 2独有12个，CPE独有19个，共有8个（中质量6个、高质量2个）；除峰1外，共有峰在CPE中强度更高，提示CPE对共有蛋白回收较强。3.5 PANTHER-GO分类（PANTHER-GO classification）：通过将27个峰对应蛋白映射至拟南芥UniProt条目并行PANTHER-GO分析，NADES 2和CPE分别获得39和80个条目；两种方法在蛋白类别、细胞组分、分子功能和生物学过程的主要类别分布趋势相似，翻译蛋白、代谢物互变酶、转运体、伴侣蛋白和蛋白修饰酶等较丰富；CPE因条目更多，命中数和类别多样性较高，独有类别极少；总体功能覆盖可比，并显示两种提取方法在蛋白选择性上互补。

讨论部分总结：研究人员认为ChCl:urea NADES表观pH接近9.0，可提供蛋白溶解所需碱性条件，随后乙酸降低pH至5.0可实现等电沉淀回收；NADES 2与NADES 1的MALDI-TOF-MS谱与CPE可比，NADES 3因较低pH和较高EC表现较差；MALDIquant结合MALDI-TOF-MS可获得并比较完整蛋白谱，PANTHER-GO显示两种方法功能覆盖相近而CPE命中数更多，NADES提取回收略低但具互补选择性。研究结论翻译：本研究首次证明，基于ChCl:urea的NADES是藜麦籽粒蛋白提取可行且高效的绿色替代方案。研究人员合成并系统表征了三种不同摩尔比的ChCl:urea NADES（NADES 1，1:2；NADES 2，1:1；NADES 3，2:1并含15%水），FTIR确认ChCl与尿素之间形成分子间氢键网络。三种NADES表观pH接近9.0，为蛋白高效溶解提供适宜碱性条件；随后加入乙酸使pH降至5.0，低于藜麦蛋白等电点，实现有效蛋白沉淀和回收，尽管回收水平略低于CPE。MALDI-TOF-MS分析显示与CPE可比的蛋白谱，尤其NADES 2和NADES 1，可能与其较高表观pH和较NADES 3更低EC有关。采用MALDIquant处理质谱共检测39个蛋白，其中27个经初步鉴定。两种方法表现出互补提取选择性，分别选择性回收12和19个独有蛋白，CPE对8个共有蛋白的提取略强。在PANTHER-GO分类水平上，两种方法在细胞定位、功能、类别和通路方面提供可比的功能覆盖。总体而言，基于ChCl:urea的NADES是藜麦蛋白提取有前景且可持续的替代溶剂，并具有扩展至其他植物基蛋白源的潜力。仍需进一步研究评估潜在毒性、残留溶剂含量及其他NADES家族的适用性，以拓展对食品基质中NADES介导蛋白提取的理解。