《Journal of Cell Communication and Signaling》：Ectopic endometrial stromal cells-derived exosomes accelerate endometriosis progression by delivering PDLIM3 to induce macrophage M2 polarization
编辑推荐：
子宫内膜异位症（Ems）是一种以侵袭和迁移为特征的良性疾病，异常表达的mRNA调控其进展。在本研究中，研究人员分析了GEO数据集，并鉴定出PDLIM3在异位子宫内膜组织中显著上调。研究旨在探讨PDLIM3在Ems进展中的作用及其调控机制。研究人员利用生物信息学
子宫内膜异位症（Ems）是一种以侵袭和迁移为特征的良性疾病，异常表达的mRNA调控其进展。在本研究中，研究人员分析了GEO数据集，并鉴定出PDLIM3在异位子宫内膜组织中显著上调。研究旨在探讨PDLIM3在Ems进展中的作用及其调控机制。研究人员利用生物信息学分析差异表达基因，并用修饰的PDLIM3和PRMT1表达载体处理子宫内膜基质细胞（ESCs），以评估其对Ems的影响。研究人员检测了巨噬细胞极化标志物及分泌的细胞因子，以及CD206阳性巨噬细胞的百分比，以评估PDLIM3/NAA40/PRMT1轴对巨噬细胞极化的影响。此外，研究人员还检测了不同条件下THP-1来源巨噬细胞（THP-1-DM）对ESCs的影响。研究人员建立了动物模型，以研究异位ESCs来源外泌体（ecESCs-Exos）所携带的PDLIM3对巨噬细胞M2极化及Ems进展的影响。M2巨噬细胞增强ecESCs的增殖和迁移，而ecESCs外泌体递送的PDLIM3可诱导巨噬细胞M2极化。在机制上，PDLIM3与NAA40结合，抑制其泛素化从而稳定其蛋白；随后增强的NAA40与PRMT1启动子结合，促进H4组蛋白的不对称二甲基化以激活PRMT1，进而驱动巨噬细胞M2极化。反过来，体外数据表明，ecESCs-Exos通过PDLIM3/PRMT1轴诱导的M2巨噬细胞进一步加速ESCs的增殖和迁移。此外，体内数据证明外泌体PDLIM3通过促进巨噬细胞M2极化加速Ems进展。来自ecESCs的外泌体PDLIM3通过诱导巨噬细胞M2极化促进Ems进展。这些发现为Ems的进展提供了新的线索，可能有助于开发Ems患者的新治疗靶点。
论文解读
一、研究背景与研究目的
子宫内膜异位症（Ems）是一种妇科良性疾病，其特征是活跃的子宫内膜基质细胞（ESCs）种植于子宫腔外，病理特征包括异位内膜周期性出血和组织纤维化。Ems发病率高，可导致不孕，给患者带来严重的健康问题。尽管过去几十年已从多方面探索了Ems的多因素病因，但其发病机制仍不明确，亟需深入探究影响Ems进展的分子机制，以改善该病的诊断和治疗。
PDZ和LIM结构域蛋白3（PDLIM3）定位于染色体4q35.1，是成熟肌纤维Z线的组成成分，在心肌、平滑肌和骨骼肌中高表达。PDLIM3在分化、增殖和信号转导等多种生物学活动中发挥关键作用，并可影响肌肉稳定性和细胞骨架结构整合。既往研究已揭示PDLIM3在肌营养不良、扩张型心肌病及多种人类癌症中的作用，但尚无研究报道PDLIM3在Ems中的功能。近年研究发现，外泌体通过调控ESCs增殖和迁移参与Ems，且Ems小鼠模型来源的外泌体可诱导巨噬细胞M2极化。更近的研究提示PDLIM3可能是Ems患者免疫浸润的潜在生物标志物，并与巨噬细胞M2极化相关。因此，本研究旨在探讨ecESCs是否通过分泌外泌体递送PDLIM3以诱导巨噬细胞M2极化，并阐明其具体功能与调控机制。
二、研究内容与主要结论
研究人员通过GEO数据库四个数据集交叉分析发现PDLIM3在异位子宫内膜组织中显著上调，并在细胞层面证实PDLIM3促进ecESCs增殖和迁移。进一步研究发现，ecESCs分泌的外泌体可直接将PDLIM3蛋白转移至巨噬细胞，诱导M2极化。机制上，PDLIM3与NAA40直接结合，抑制NAA40的泛素化降解从而稳定其蛋白水平；增强的NAA40结合至PRMT1启动子区域，促进H4组蛋白不对称二甲基化（H4R3me2a）以转录激活PRMT1，进而驱动巨噬细胞M2极化。M2巨噬细胞反过来进一步增强ESCs的增殖和迁移能力。动物模型实验证实，ecESCs来源的外泌体PDLIM3通过诱导巨噬细胞M2极化加速异位内膜形成。此外，研究人员还揭示了PDLIM3在ecESCs中上调的上游机制：异位内膜中DNA甲基转移酶1（DNMT1）表达降低，导致PDLIM3启动子区域DNA甲基化水平下降，从而重新激活PDLIM3表达。
本研究的重要意义在于首次阐明了PDLIM3在Ems中的作用及其分子机制，揭示了ecESCs来源外泌体递送PDLIM3通过PDLIM3/NAA40/PRMT1轴诱导巨噬细胞M2极化从而促进Ems进展的全新信号通路，为Ems的发病机制提供了新见解，并为开发新的治疗靶点提供了理论依据。
三、关键技术与方法
本研究使用了以下主要技术方法：利用GEO数据库（GSE5108、GSE86534、GSE11691、GSE47361、GSE87621数据集）进行生物信息学差异表达基因分析和DNA甲基化分析；从苏州大学附属第一医院获取临床样本，分离培养人正常子宫内膜基质细胞（nESCs，来源于子宫肌瘤患者的正常周期子宫内膜）和异位子宫内膜基质细胞（ecESCs，来源于Ems患者的卵巢囊肿剥除术或卵巢切除术标本），并从健康供体外周血中分离单核细胞诱导分化为原代人巨噬细胞（hMDM）；采用慢病毒介导的短发夹RNA（shRNA）敲低和质粒过表达进行细胞功能实验；通过超速离心法提取外泌体并利用透射电镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）和PKH26荧光标记进行外泌体鉴定与示踪；运用免疫共沉淀（Co-IP）结合质谱分析、GST pull-down、泛素化检测、染色质免疫沉淀（ChIP）、甲基化特异性PCR（MSP）等分子生物学技术解析蛋白互作和表观调控机制；流式细胞术检测CD206阳性巨噬细胞比例；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞因子分泌水平；最后建立SD大鼠Ems模型进行体内验证。
四、研究结果
3.1 M2巨噬细胞促进ecESCs的增殖和迁移表型
研究人员用IL-4诱导THP-1单核细胞系分化为M2巨噬细胞，流式细胞术确认CD206表达显著升高。与M2巨噬细胞共培养后，ecESCs的活性、增殖和迁移能力均显著增强。免疫荧光显示异位内膜组织中M2巨噬细胞标志物显著高于正常内膜组织。共培养后THP-1-DM细胞中M2标志物（CD163、ARG1、MRC1）表达及IL-10、TGF-β、CCL22分泌水平均显著升高。
3.2 PDLIM3促进巨噬细胞M2极化和ecESCs发育
通过GEO四个数据集交叉分析发现PDLIM3在异位内膜组织中上调，RT-qPCR和western blot证实ecESCs中PDLIM3表达显著高于nESCs。相关性分析显示PDLIM3高表达与M2极化正相关。敲低ecESCs中PDLIM3后，共培养体系中THP-1-DM的M2标志物表达、M2细胞因子分泌和CD206阳性比例均显著下降。功能实验表明，敲低PDLIM3抑制ecESCs的活性、增殖和迁移，而过表达PDLIM3则促进nESCs的活性、增殖和迁移。
3.3 ecESCs分泌的外泌体递送PDLIM3诱导巨噬细胞M2极化
加入外泌体分泌抑制剂GW4869后，ecESCs共培养诱导的M2极化效应被消除。透射电镜观察确认外泌体形态，western blot检测到外泌体表面标志物CD81和TSG101阳性而阴性标志物calnexin阴性。NTA分析外泌体直径和浓度，PKH26染色实现外泌体示踪。ecESCs-Exos处理后THP-1-DM中PDLIM3 mRNA和蛋白均显著升高，且敲低ecESCs中PDLIM3可逆转此效应。蛋白合成抑制剂CHX处理不影响PDLIM3的升高，证明是外泌体直接递送PDLIM3蛋白而非诱导内源表达。敲低PDLIM3的ecESCs来源外泌体不再能诱导M2极化，原代hMDM中结果一致。
3.4 PDLIM3与NAA40相互作用并稳定NAA40蛋白
Co-IP结合质谱分析鉴定出NAA40为PDLIM3的相互作用蛋白，并在THP-1-DM中通过Co-IP和western blot验证。GST pull-down确定NAA40与PDLIM3的第184-293区域结合。过表达PDLIM3延长NAA40蛋白半衰期，且该效应可被蛋白酶体抑制剂MG132逆转而非自噬抑制剂BafA1，表明PDLIM3通过蛋白酶体途径抑制NAA40降解。泛素化实验证实PDLIM3以剂量依赖性方式抑制NAA40的泛素化水平。
3.5 NAA40激活PRMT1促进巨噬细胞M2极化
敲低NAA40后，N-acH4和H4R3me2a水平显著降低，PRMT1的mRNA和蛋白表达均下调。ChIP-qPCR证实NAA40富集于PRMT1启动子区域，敲低NAA40后PRMT1启动子区域N-acH4水平降低、H3K4me3水平下降而H3K27me3水平升高。回补实验中，敲低NAA40导致的M2标志物下降、细胞因子分泌减少和CD206阳性比例降低均可被PRMT1过表达恢复。
3.6 外泌体PDLIM3通过上调PRMT1诱导M2极化促进ESCs生长和迁移
在ecESCs和nESCs中均证实，ecESCs-Exos处理的THP-1-DM促进ESCs活性、增殖和迁移的效应在PDLIM3敲低后被抑制，而PRMT1过表达可恢复这些效应。
3.7 DNMT1介导的PDLIM3在ecESCs中上调
GSE87621数据集显示异位内膜ESCs中PDLIM3启动子DNA甲基化水平降低，MethPrimer网站预测PDLIM3启动子区域存在两个CpG岛。MSP证实ecESCs中PDLIM3启动子甲基化水平显著低于nESCs。RT-qPCR筛选发现DNMT1在ecESCs中表达显著降低，ChIP证实DNMT1富集于PDLIM3启动子区域。过表达DNMT1后PDLIM3 mRNA表达下降，且PDLIM3启动子甲基化水平升高。
3.8 外泌体PDLIM3促进大鼠模型异位内膜形成和巨噬细胞M2极化
大鼠Ems模型中，ecESCs-Exos注射进一步增大异位内膜囊肿体积并促进异位内膜形成，而PDLIM3敲低或氯膦酸盐脂质体清除巨噬细胞后这些效应被逆转。各处理组大鼠体重无显著差异。M2标志物表达和CD206阳性巨噬细胞比例的变化与上述趋势一致。
五、讨论与结论
讨论部分指出，DNA甲基化是调控RNA表达的关键表观遗传重编程机制，DNMT1作为表观遗传失活蛋白可导致其靶基因下调，本研究证实DNMT1可强结合PDLIM3启动子并负调控其表达。功能上，PDLIM3高表达促进Ems进展。免疫功能障碍如巨噬细胞极化异常参与Ems发生发展，Ems患者腹腔液和内膜病灶中M2巨噬细胞数量增加。在健康女性中，巨噬细胞通过吞噬功能清除月经碎片并维持稳态；而在Ems病灶中，巨噬细胞吞噬能力下降，反而促进血管生成、纤维化、氧化应激诱导的慢性炎症、神经相互作用、雌激素依赖和孕激素抵抗。Ems来源的外泌体可影响巨噬细胞极化。本研究证实巨噬细胞可捕获ecESCs来源的外泌体，PDLIM3通过外泌体直接转移至巨噬细胞并诱导M2极化。机制上，PDLIM3与NAA40相互作用抑制其泛素化并增强其水平，NAA40介导的N-acH4通过调控相邻H4R3me2a标记控制特定基因表达，NAA40结合PRMT1启动子区域介导H4R3me2a增强PRMT1表达。PRMT1的差异表达与巨噬细胞极化相关。动物模型数据支持ecESCs-Exos递送PDLIM3加速巨噬细胞M2极化从而加重Ems进展。
研究结论：本研究证明PDLIM3在Ems患者的ESCs中表达上调，PDLIM3促进nESCs和ecESCs的增殖和迁移。PDLIM3可由ecESCs-Exos递送至巨噬细胞，通过稳定NAA40上调PRMT1诱导M2极化，此类巨噬细胞进一步促进ESCs增殖和迁移，最终加重Ems进展。
