多组学解析水杨酸与乙烯响应转录因子PnERF120介导的三七抗三七病毒Y防御机制

《Molecular Plant Pathology》：Multi-Omics Analysis Uncovers the Salicylic Acid and Ethylene-Responsive Transcription Factor-Mediated Defence Mechanism of Panax notoginseng to Panax notoginseng Virus Y

　　

三七（Panax notoginseng）是食用传统药用植物，但高度易感三七病毒Y（Panax notoginseng virus Y，PnVY）。本研究揭示水杨酸（salicylic acid，SA）处理可降低这种易感性。研究人员通过整合生理学、多组学和遗传学方法阐明了其潜在分子机制。SA施用缓解PnVY诱导的光合抑制并激活抗氧化酶，从而降低活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平并维持氧化还原稳态。接种PnVY后，SA触发一系列防御反应。外源施用SA促进苯丙烷类（phenylpropanoids）、生物碱（alkaloids）和类黄酮（flavonoids）积累，这与苯丙烷类生物合成相关基因表达上调一致。转录调控网络分析揭示，乙烯响应转录因子（ethylene-responsive transcription factor）PnERF120可能正调控包括SA在内的酚酸（phenolic acids）生物合成。过表达PnERF120增强三七对PnVY的抗性，激活SA生物合成和信号转导途径，上调RNA沉默相关基因并提高酚酸积累。然而，沉默三七中的PnERF120产生相反效应。此外，酵母单杂交（yeast one-hybrid，Y1H）和双荧光素酶（dual-luciferase，Dual-LUC）实验表明，PnERF120结合PnPAL1启动子并激活PnPAL1表达。总之，PnERF120通过调控SA生物合成和SA信号通路正调控对PnVY感染的防御。

植物病毒病是仅次于真菌病害的第二大植物病害类别，病毒感染会破坏宿主细胞代谢、蛋白质合成和能量转换，导致生长迟缓、叶片黄化或坏死等症状并造成产量损失；植物则通过氧化胁迫响应、RNA沉默、自噬、激素信号和代谢重编程等机制防御病毒感染。水杨酸（salicylic acid，SA）是广泛研究的酚酸类植物激素，可激活模式触发免疫（pattern-triggered immunity，PTI）、效应触发免疫（effector-triggered immunity，ETI）和系统获得性抗性（systemic acquired resistance，SAR），在多种植物—病毒系统中限制病毒扩展；类黄酮、生物碱和酚酸等次生代谢物也参与抗病毒防御。三七（Panax notoginseng）是食用传统药用植物，主要栽培于中国云南省文山州，受三七病毒Y（Panax notoginseng virus Y，PnVY）、黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）和番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）等病原病毒影响，其中PnVY是文山种植基地的主要病毒病原，侵染后引起叶片黄化和皱缩。病毒感染会严重扰乱三七光合作用和能量代谢，并激活SA信号、MAPK信号和抗氧化防御系统。外源SA能否降低三七对PnVY的易感性及其分子基础尚需阐明，因此研究人员开展本研究，以解析SA介导三七抗PnVY防御的分子机制，并鉴定防御相关基因、转录因子和代谢物，为抗病毒策略和育种提供依据。

关键技术方法概括（不超过250字）：以田间采集并经RT-PCR和常规PCR筛选为仅PnVY阳性、其他测试病毒阴性的三七叶片制备病毒悬液；采用二年生健康三七遮阴栽培，针刺法接种，并喷施200 μM SA或SA合成抑制剂2-aminoindan-2-phosphonic acid（AIP）；RT-qPCR检测PnVY载量和基因表达；测定光合及抗氧化酶活性、叶绿素和ROS；进行Illumina NovaSeq 6000转录组分析（HISAT2比对、edgeR差异表达、KEGG富集）；进行UPLC-MS/MS代谢组分析（Orbitrap Exploris 120，HMDB、MassBank和KEGG注释）；HPLC定量酚酸；采用加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）；构建PnERF120过表达株（根茎农杆菌介导转化）和病毒诱导基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）株；开展Y1H和Dual-LUC实验。

研究结果如下。2.1 SA诱导三七对PnVY的抗性：对PnVY接种叶片喷施SA或AIP后发现，SA处理显著降低对PnVY的易感性并延迟褪绿，14天接种后天数（days post-inoculation，dpi）时PnVY载量较Mock组低65%；AIP处理加重黄化，PnVY载量分别较Mock组和SA处理组高1.8倍和2.0倍；据此建立Mock、I、SA和SA_I四组用于后续分析，结论为外源SA抑制PnVY侵染。2.2 外源施用SA改变三七内源激素：内源激素测定显示，PnVY侵染提高SA、吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）、赤霉酸（gibberellic acid，GA₃）和脱落酸（abscisic acid，ABA）含量；外源SA使SA_I组内源SA较I组提高51.9%，IAA提高11.8%；SA_I组中PnPAL1、PnICS1、PnBA2H1、PnNPR1、PnEDS1和PnTGA1表达较I组分别提高1.7、1.5、3.4、2.5、1.9和6.1倍，结论为外源SA增强内源SA积累并激活SA信号。2.3 SA缓解PnVY对光合作用的抑制：基因表达、酶活、叶绿素和光合产物测定表明，PnVY下调RuBisCO、FBA、FBP、FNR、GluTR和ATPase；SA_I组上述基因表达较I组提高2.3、1.5、2.1、1.4、1.4和1.6倍，相应酶活提高1.3、1.04、1.4、1.4、1.5和1.2倍；叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素提高2.9、1.2和2.0倍，葡萄糖、果糖和蔗糖提高30.9%、12.6%和2.2%，结论为SA缓解病毒导致的光合抑制。2.4 外源SA维持PnVY侵染三七的氧化还原稳态：ROS检测和抗氧化指标显示，PnVY使RBOH表达较Mock高2.9倍、ROS高1.4倍；SA_I组较I组RBOH表达低24.2%、ROS低18.6%；SA_I组SOD、POD和CAT基因表达较I组高1.6、2.2和2.0倍，酶活高1.6、1.5和1.3倍，结论为SA减轻病毒触发的氧化胁迫并维持氧化还原稳态。2.5 SA处理PnVY侵染三七的转录组图谱：RNA-seq获得231.44 Gb clean data，Q30>87.3%，GC含量42.5%–43.4%；以倍数变化>1.5且p<0.05筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），I、SA和SA_I组在7/14 dpi较Mock分别有752/1012、1150/1143和4297/928个DEGs高表达；KEGG富集涉及植物激素信号转导、植物—病原互作、苯丙烷生物合成、二萜生物合成、类黄酮生物合成、谷胱甘肽代谢和不饱和脂肪酸生物合成等；SA_I组中BC、LPC、LPCAT、FAD和SAD等不饱和脂肪酸合成基因上调，谷胱甘肽代谢上调，苯丙烷生物合成在7和14 dpi均激活；DCLs、AGOs和RDRs等RNA沉默基因在SA和SA_I组较高且SA_I组最高，结论为外源SA上调RNA沉默相关基因并激活多条防御通路。2.6 SA施用改变PnVY侵染三七的代谢物谱：UPLC-MS/MS检测到28030个负离子和23050个正离子，注释11089个植物化学化合物，其中3482个次生代谢物；7和14 dpi分别鉴定503和1052个差异积累代谢物（differentially accumulated metabolites，DAMs），生物碱、苯丙烷和萜类为主要类别；SA_I与Mock组间分别有37%和46%的苯丙烷在7和14 dpi差异积累，14 dpi有40%生物碱和33%萜类差异积累；SA_I与Mock组特有DAMs在7和14 dpi分别为63和113个；KEGG富集涉及吲哚生物碱、黄酮和黄酮醇、苯丙烷、玉米素、黄烷酮、二萜、花青素等生物合成；SA_I组中strictosidine aglycone等吲哚生物碱及luteolin 7-O-β-d-glucoside、quercetin和scolymoside高于I组，结论为SA改变代谢谱并促进防御相关代谢物积累。2.7 整合多组学分析揭示SA及其他酚酸积累在三七抗病毒防御中的重要性：整合转录组和代谢组发现，14 dpi SA_I组较I组积累更多casbene、ent-copalyl diphosphate、neoabietadiene、paclitaxel、isopimaradienal、gibberellin A24和levopimaric acid等二萜类，二萜合成相关基因TDC1、AG22、BAPT、LPS、TPS-ISO、GA20ox、ACS和CYP76AH3表达升高；SA_I组较I组SA、肉桂酸、绿原酸、阿魏酸和芥子酸含量分别高3.1、4.3、1.8、2.2和3.7倍；总酚酸在7和14 dpi均以SA_I组较高；HPLC确认14 dpi SA_I组肉桂酸和芥子酸含量为58.1和47.3 μg/g DW，I组为29.4和35.1 μg/g DW；苯丙烷途径基因PAL、4CL、C3′H、COMT、F5H、CCoAOMT、CAD和POD在SA_I组较I组表达升高，COMT在7和14 dpi分别高2.2和3.2倍，结论为SA激活苯丙烷途径并诱导酚酸积累，增强抗病毒防御。2.8 鉴定调控防御相关代谢物积累并与SA互作响应PnVY侵染的转录网络：14 dpi鉴定1091个转录因子，I、SA和SA_I组分别有130、135和152个差异表达转录因子（differentially expressed transcription factors，DETFs），属于20个转录因子家族，WRKY、bHLH、ERF、NAC和MYB最突出；WGCNA将417个DETFs和1052个DAMs划分为10个模块，turquoise模块含24个DETFs和79个DAMs且相关性最高，包含生物碱、萜类和苯丙烷等防御相关代谢物；ρ>0.85提示scoparone、coumarin和O-ethylxanthotoxol等香豆素类积累可能受PnWRKY22调控；PnERF120与SA、肉桂酸、绿原酸、阿魏酸和芥子酸等酚酸ρ>0.85，与PnPAL1和PnPAL2的ρ>0.75，结论为PnERF120可能调控包括SA在内的酚酸生物合成以参与抗PnVY防御。2.9 PnERF120通过激活SA信号和增强酚酸生物合成正调控对PnVY抗性：克隆PnERF120并构建过表达和沉默株；过表达株叶片黄化程度低于野生型（wild type，WT），PnVY载量仅为WT的49.9%，总酚酸增加2.3倍，肉桂酸、绿原酸、阿魏酸和芥子酸增加2.2、1.1、1.6和2.3倍，内源SA增加2.4倍；过表达株中PnNPR1、PnTGA1、PnPR1及PnDCL2、PnDCL3、PnAGO1、PnRDR1、PnRDR6上调，PnPAL1和PnPAL2表达高3.9和3.7倍；沉默株抗性下降，PnVY载量高2.0倍，总SA低45.8%，SA信号和RNA沉默相关基因受抑，总酚酸低16.5%，肉桂酸、绿原酸、阿魏酸和芥子酸降低21.4%、25.0%、29.8%和22.0%，PnPAL1和PnPAL2表达降低70.4%和52.0%，结论为PnERF120正调控SA介导的防御通路和酚酸生物合成。2.10 PnERF120正调控PnPAL1表达：生物信息学分析发现PnPAL1启动子含GCCGCC-box；Y1H实验显示PnERF120结合PnPAL1启动子，Dual-LUC实验显示PnERF120使PnPAL1启动子活性提高2.2倍，结论为PnERF120结合并激活PnPAL1启动子，从而增强其转录。

讨论部分指出，外源SA可降低PnVY积累和症状严重度，而抑制SA生物合成增加易感性；SA处理提高内源SA水平并上调SA生物合成和信号关键基因，说明SA对三七抗病毒防御至关重要。SA可缓解PnVY诱导的光合抑制，并通过谷胱甘肽代谢和抗氧化系统减轻氧化损伤；多组学显示植物激素信号、植物—病原互作、氨基糖和糖代谢、不饱和脂肪酸、谷胱甘肽及萜类/生物碱/苯丙烷代谢受SA和PnVY影响，表明SA通过多层面系统代谢重编程正调控三七抗病毒抗性。讨论还指出，SA促进酚酸、二萜和生物碱积累，可能贡献于抗病毒防御，但高积累次生代谢物的具体贡献仍需进一步研究；转录因子与SA信号精细互作，PnERF120过表达增强抗性并提高内源SA和SA信号基因表达，沉默则相反，且PnERF120通过结合PnPAL1启动子激活其表达，说明PnERF120通过调控SA生物合成和SA信号通路正调控三七对PnVY的抗性。讨论进一步指出，SA显著上调DCLs、AGOs和RDRs等RNA沉默基因，PnERF120正调控PnDCL2、PnDCL3、PnAGO1、PnRDR1和PnRDR6，提示SA诱导的抗病毒反应部分依赖RNA沉默，未来需阐明SA与RNA沉默连接防御病毒的完整调控网络。研究结论翻译为：本研究表明，外源施用SA通过提高内源SA水平、缓解光合抑制并通过激活谷胱甘肽代谢维持细胞氧化还原稳态，增强三七对PnVY的抗性；整合转录组和代谢组分析进一步揭示，SA促进酚酸、二萜和生物碱积累，这些代谢物可能有助于抗病毒防御；PnERF120被鉴定为SA生物合成和信号通路的正调控因子；总体而言，这些发现阐明了SA在三七中的多层面抗病毒机制，涉及代谢重编程和转录因子调控。