紫苏酸（Perillic acid, PA）微乳制剂协同米替福星（miltefosine）增强抗Leishmania amazonensis活性并显著降低皮肤利什曼病寄生虫负荷

《Parasite Immunology》：Perillic Acid Synergizes With the Miltefosine Leishmanicidal Effect Against Leishmania amazonensis

　　

紫苏酸（Perillic acid, PA）是一种来源于柠檬烯（limonene）的单环单萜，研究人员评估了其单用、与米替福星（miltefosine）联用以及其微乳（microemulsion）制剂的抗利什曼原虫（leishmanicidal）活性。PA与米替福星表现出协同活性，并对Leishmania amazonensis的前鞭毛体（promastigote）和无鞭毛体（amastigote）两种形态均有效。其抗无鞭毛体作用不依赖一氧化氮（nitric oxide, NO）产生，但与受刺激巨噬细胞中精氨酸酶（arginase）活性降低部分相关。在皮肤利什曼病（cutaneous leishmaniasis）小鼠模型中，负载PA的微乳局部治疗使寄生虫负荷显著降低，在L. amazonensis感染中实现99%的降低。PA在不同给药途径下也显示出体内（in vivo）疗效，并且以微乳制剂给药时表现出显著的皮肤渗透性。这些发现突出PA作为一种有前景的抗利什曼原虫药物，并支持其在皮肤利什曼病治疗中的潜在应用。

研究背景与意义：利什曼病（leishmaniasis）是一种在五大洲98个国家流行的被忽视疾病，每年约5万–9万例内脏利什曼病（visceral leishmaniasis, VL）和70万–100万例皮肤利什曼病（cutaneous leishmaniasis, CL）。五价锑剂作为一线治疗已超过80年，但毒性高和不良反应导致患者停药并增加耐药虫株；戊脒、两性霉素B和巴龙霉素等替代药物仍有细胞毒性。米替福星（miltefosine）是首个获批口服治疗利什曼病的药物，2002年起在印度用于VL并取得高治愈率，但其对CL的疗效存在地理差异且具有致畸性。紫苏酸（Perillic acid, PA；来源于柠檬烯的单环单萜代谢物）已在包括人类在内的多种哺乳动物中鉴定；其可抑制法尼基转移酶和香叶基香叶基转移酶、引起G₀/G₁期细胞周期阻滞、抑制肺癌和结肠癌细胞增殖，并抑制HSV从感染Vero细胞释放。微乳（microemulsion, ME；透明、热力学稳定的单相分散系统）由水、油、表面活性剂及多数情况下的助溶剂组成，液滴粒径通常10–100 nm，可提高药物溶解度并促进药物向角质层分配，是透皮/皮肤给药的重要载体。基于PA的活性和ME递送优势，研究人员评估未制剂PA、PA微乳及其与米替福星联用对Leishmania amazonensis（L. amazonensis）的作用；该虫在人类可引起CL、严重无反应性弥漫性CL和内脏型疾病。研究旨在明确PA单用和联用的抗利什曼原虫（leishmanicidal）效果、微乳制剂的体内外作用及局部递送潜力，为CL治疗提供候选化合物和制剂策略。结果得出PA与米替福星协同、PA微乳局部治疗显著降低寄生虫负荷等结论，提示PA是药物开发和新型抗利什曼原虫药物设计的有前景化合物，并支持其CL治疗潜在应用。

主要关键技术与样本来源：采用雌性BALB/c小鼠（8–10周；动物设施：Federal Fluminense University，Rio de Janeiro，RJ，Brazil；饲养于Federal University of Rio de Janeiro，Rio de Janeiro，RJ，Brazil）及L. amazonensis（WHOM/BR/75/Josefa）。关键技术包括前鞭毛体（promastigote）生长计数、腹膜巨噬细胞（macrophage）感染无鞭毛体（amastigote）模型、寄生虫救援转化实验、XTT（四唑盐代谢活性检测）与台盼蓝（Trypan blue）排除法、吞噬实验、Griess法（检测亚硝酸盐）测一氧化氮（nitric oxide, NO）、精氨酸酶（arginase）活性、分数抑制浓度指数（fractional inhibitory concentration index, FIC）与等辐射图（isobologram）分析、微乳粒径动态光散射、足垫感染模型腹腔/局部给药及限菌稀释法测寄生虫负荷、天冬氨酸氨基转移酶（AST）/丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测。

研究结果：
3.1 抗前鞭毛体活性（Anti-Promastigote Activity）：通过不同浓度PA处理L. amazonensis前鞭毛体并在24、48、72、96 h计数活体运动虫体，研究人员发现100、200、500 μM PA在7天时分别抑制26.68%、43.37%和89.88%的生长，IC₅₀为239.6 μM。
3.2 宿主细胞活力实验（Host Cell Viability Assays）：通过XTT法、台盼蓝排除法和吞噬实验评价PA对小鼠腹膜巨噬细胞的影响，发现至200 μM不明显影响代谢活性，500 μM后77%细胞仍存活，200 μM不影响1 h和24 h的吞噬。
3.3 抗无鞭毛体活性（Antiamastigote Activity）：通过感染巨噬细胞处理24 h并以Giemsa计数及救援转化实验验证，1、10、25、50、100、200 μM PA分别杀灭22%、28%、36%、45%、59%、61%无鞭毛体，IC₅₀为63.8 μM；米替福星IC₅₀为14.08 μM。
3.4 分数抑制浓度指数与等辐射图分析（Fractional Inhibitory Concentration Index and Isobologram Analysis）：通过计算单用和联用的IC₅₀得到FIC并绘制等辐射图，联合实验点位于相加线下方，平均ΣFIC为0.493 ± 0.228，表明对无鞭毛体呈协同作用。
3.5 一氧化氮产生（Nitric Oxide Production）：通过Griess法检测感染/未感染及干扰素-γ（IFN-γ）刺激巨噬细胞的亚硝酸盐，发现PA不诱导NO产生，说明抗利什曼作用不依赖NO诱导。
3.6 巨噬细胞精氨酸酶活性评价（Evaluation of Macrophage Arginase Activity）：通过测定未刺激或白细胞介素-4（IL-4）刺激巨噬细胞裂解液的精氨酸酶活性，发现无刺激时200 μM PA不显著降低，IL-4刺激后PA使活性降低约1.52倍，N-hydroxy-L-arginine（NOHA）约1.54倍。
3.7 体内抗利什曼活性（In Vivo Antileishmanial Activity）：通过足垫感染小鼠的腹腔和局部给药实验及限菌稀释法测负荷，腹腔PA 50 mg/kg/day 10次使病灶缩小35.7%，局部PA微乳1 mg/mL 10次缩小38%；两途径均抑制99%寄生虫负荷，两性霉素B腹腔亦抑制99%；腹腔PA、DMSO和两性霉素B未改变血AST/ALT。

讨论总结：研究人员在讨论中指出，PA对前鞭毛体从第5天起抑制90%，对胞内无鞭毛体更有效，单次24 h处理IC₅₀为63.8 μM；米替福星对胞内无鞭毛体IC₅₀为14.08 μM，但存在致畸性、治疗窗窄及耐药相关局限。联合治疗可降低毒性、缩短疗程和成本并延长药物寿命；PA与米替福星ΣFIC 0.493提示协同，PA值得进一步研究联合治疗。XTT和台盼蓝显示至500 μM未见腹膜巨噬细胞毒性，PA不影响巨噬细胞吞噬，且不改变血AST/ALT。机制上，PA不诱导巨噬细胞NO产生；IL-4刺激后PA使精氨酸酶活性降低约1.52倍，NOHA降低约1.54倍，这可能部分解释其通过多胺合成途径发挥抗利什曼作用。微乳局部PA较腹腔PA更有效缩小病灶，两种途径降低寄生虫负荷相似，且透皮所需剂量低50倍；在雌性小鼠这一较严重模型中，PA微乳局部治疗仍有效。讨论还指出局部治疗可减少停药和耐药，世界卫生组织（WHO）推荐用于CL的局部方案为巴龙霉素加甲苄索氯铵软膏20天，对L. major所致CL治愈率67%–77%；巴龙霉素加0.5%庆大霉素对L. major和L. braziliensis治愈率80%和82%；2%两性霉素B凡士林制剂使2例L. infantum所致CL消退且无复发。

研究结论翻译：研究人员的这些结果表明，PA在体外（in vitro）和体内（in vivo）均具有抗L. amazonensis活性。此外，经透皮（transdermal）途径给予PA微乳在缩小病灶尺寸方面比腹腔内（intraperitoneal）给药更有效，尽管两种途径对寄生虫负荷的降低程度相当。尚需进一步研究以充分探索微乳作为局部抗利什曼原虫治疗递送系统的潜力，尤其是针对PA。总体而言，PA似乎是药物开发和新型抗利什曼原虫药物设计中一种有前景的化合物。