Butein通过Nrf2–Sirt3信号轴协调恢复氧化还原–线粒体稳态并减轻病理性心肌肥厚

《Phytotherapy Research》：Butein Attenuates Cardiac Hypertrophy by Restoring Redox–Mitochondrial Homeostasis Through Nrf2–Sirt3 Signaling

　　

Butein（3,4,2′,4′-tetrahydroxychalcone，3,4,2′,4′-四羟基查尔酮）是一种具有抗氧化、抗炎和细胞保护作用的生物活性查尔酮。然而，其对病理性心肌肥厚的作用及潜在分子机制仍不清楚。本研究采用苯肾上腺素（phenylephrine，PE）刺激的新生大鼠心室心肌细胞（neonatal rat ventricular cardiomyocytes，NRVM）以及2周和8周横向主动脉缩窄（transverse aortic constriction，TAC）小鼠模型，在体外和体内研究Butein的保护作用。Butein显著减轻心肌细胞肥厚，降低细胞内和线粒体活性氧（reactive oxygen species，ROS），维持线粒体膜电位，并恢复线粒体生物能量状态。机制上，Butein增强Nrf2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，核因子红细胞2相关因子2）的核积累，恢复抗氧化基因表达，并重新激活AMPK（AMP-activated protein kinase，AMP活化蛋白激酶）–Sirt3（Sirtuin 3）–FoxO3a（forkhead box O3a）信号，同时逆转SOD2（superoxide dismutase 2，超氧化物歧化酶2）过度乙酰化。在体内，Butein在早期代偿阶段（2周TAC）抑制心脏肥厚，并在晚期病理阶段（8周TAC）减轻心脏重构、纤维化和功能恶化。值得注意的是，Nrf2或Sirt3的基因沉默以及Nrf2的药理抑制减弱了Butein的保护作用，支持Nrf2–Sirt3信号在体外和体内均参与其中。总体而言，这些发现表明，Butein通过协调的Nrf2–Sirt3信号恢复氧化还原和线粒体稳态，从而减轻病理性心肌肥厚。

研究背景方面，病理性心肌肥厚（pathological cardiac hypertrophy）是慢性血流动力学应激的适应不良反应，也是心力衰竭、心律失常和心源性猝死的重要风险因素。现有肾素–血管紧张素–醛固酮系统抑制剂和β受体阻滞剂仅能部分延缓疾病进展，不能直接靶向驱动适应性肥厚向病理性重构转变的细胞内应激通路。氧化应激和线粒体功能障碍被认为是肥厚性重构和心功能恶化的重要机制；过量ROS、线粒体膜电位受损、生物能量状态改变及线粒体质量控制紊乱可加剧适应不良性生长信号和心肌损伤。Nrf2是细胞抗氧化防御和氧化还原平衡的关键调节因子，但病理性肥厚应激常伴随Nrf2激活受损而非适当代偿性抗氧化反应。Sirt3是一种线粒体NAD⁺依赖性去乙酰化酶，在维持线粒体完整性和代谢稳态、清除线粒体ROS中起关键作用，其缺失与心脏肥厚、线粒体功能障碍和氧化损伤相关。Nrf2与Sirt3在应激适应通路中功能互联，但天然化合物是否通过Nrf2依赖的Sirt3调控在压力超负荷诱导心脏重构中发挥抗肥厚作用尚不充分清楚。Butein具有抗氧化、抗炎、抗纤维化和细胞保护活性，且既往研究提示其可经ERK/Nrf2信号保护心肌细胞对抗氧化应激损伤并改善线粒体功能，但其能否保护病理性心肌肥厚及是否通过整合调控氧化还原和线粒体稳态发挥作用仍不明确。因此，研究人员在体外和体内评估Butein是否通过Nrf2/Sirt3信号恢复氧化还原和线粒体稳态，从而减轻病理性心肌肥厚。研究结论表明，Butein通过协调的Nrf2–Sirt3信号减轻病理性心肌肥厚；其意义在于支持将整合的氧化还原–线粒体应激通路作为限制病理性心肌肥厚和心力衰竭进展的潜在治疗靶点。

方法概括（不超过250字）：研究使用1–2日龄Sprague Dawley大鼠来源的NRVM，以及购自Saeronbio的雄性C57BL/6小鼠建立2周和8周TAC模型；以PE诱导NRVM肥厚，Butein按1、3、5 μmol/L梯度处理，体内按10、20、40 mg/kg腹腔给药，并用ML385进行Nrf2药理抑制。关键技术包括免疫荧光与细胞表面积定量、qRT-PCR、活细胞荧光（DCFH-DA、JC-1、MitoSOX）、NAD⁺/ATP生物能量检测、Western blot与核分离、Nrf2/Sirt3 siRNA转染、TAC、超声心动图以及H&E、Masson和WGA（wheat germ agglutinin，小麦胚芽凝集素）组织学分析。

研究结果如下。3.1 Butein减轻PE诱导NRVM的肥厚反应和氧化应激：通过α-actinin免疫荧光和qRT-PCR检测，Butein剂量依赖性减小PE诱导的心肌细胞表面积，抑制Nppa、Nppb和Myh7表达；DCFH-DA检测显示其降低细胞内ROS，Western blot显示其恢复SOD1、catalase和GPx1/2表达。3.2 Butein恢复PE诱导肥厚NRVM的线粒体生物能量和氧化还原稳态：检测NAD⁺和ATP水平、线粒体生物发生与能量代谢相关基因、JC-1及MitoSOX，发现Butein恢复NAD⁺和ATP水平，上调Ppargc1a、mt-Atp8、Esrra、Nrf1、Ppara和Tfam表达，维持线粒体膜电位并减少线粒体超氧化物。3.3 Butein抑制PE诱导肥厚NRVM的应激反应性ER应激和MAPK信号通路：Western blot显示Butein抑制PERK和eIF2α磷酸化，降低ATF4、CHOP和GADD45α表达，并剂量依赖性抑制ERK1/2、JNK和p38磷酸化。3.4 Butein恢复PE诱导肥厚NRVM中Nrf2相关抗氧化信号和线粒体应激适应反应：核分离Western blot和免疫荧光显示Butein恢复核Nrf2水平及核定位，qRT-PCR显示其恢复Nqo1、Hmox1和Gclc表达；同时恢复AMPK磷酸化及Sirt3、FoxO3a和SOD2表达，并逆转SOD2 K68/K122乙酰化。3.5 Butein在早期代偿阶段减轻压力超负荷诱导的心脏肥厚：2周TAC模型中，Butein降低HW/BW比值，减轻H&E所示心脏肥厚和WGA所示心肌细胞表面积增加，并抑制Nppa、Nppb和Myh7上调。3.6 Butein在早期代偿阶段恢复Nrf2相关抗氧化信号和线粒体应激适应反应：2周TAC心脏中，Butein恢复核Nrf2积累及Nqo1、Hmox1、Gclc表达，并恢复AMPK磷酸化、Sirt3、SOD2和FoxO3a表达，逆转SOD2 K68/K122过度乙酰化。3.7 Butein在晚期阶段减轻病理性心脏肥厚和功能恶化：8周TAC模型中，超声心动图显示Butein改善LVIDd、LVIDs、EF和FS，降低HW/BW比值，减轻心脏扩大、WGA所示心肌细胞表面积增加及Masson所示血管周围和间质纤维化，并抑制Nppa、Nppb和Myh7上调。3.8 Nrf2介导Butein对PE诱导心肌细胞肥厚的保护作用：siRNA沉默Nrf2后，Butein上调Nrf2和Sirt3的作用受损，其抗肥厚、降低ROS、维持线粒体膜电位和减少线粒体超氧化物的保护作用被显著削弱。3.9 Sirt3敲低减弱Butein在PE处理NRVM中的保护作用：siRNA沉默Sirt3降低Sirt3表达而不显著影响Nrf2，并减弱Butein抑制PE诱导肥厚、肥厚基因表达、线粒体膜去极化和线粒体超氧化物生成的作用。3.10 Nrf2药理抑制减弱Butein在压力超负荷诱导心脏肥厚中的心脏保护作用：2周TAC模型中，ML385（Nrf2抑制剂）减弱Butein降低HW/BW比值、WGA所示心肌细胞表面积及Nppa、Nppb和Myh7表达的作用。

讨论部分总结：研究支持Butein在压力超负荷诱导病理性心肌肥厚中具有较广的心脏保护作用，机制涉及恢复Nrf2依赖的抗氧化防御和线粒体应激适应信号，并抑制ER应激和MAPK信号。Butein preserved线粒体膜电位、生物能量状态和线粒体生物发生相关转录调控，减少线粒体超氧化物；AMPK–Sirt3–FoxO3a激活及SOD2过度乙酰化逆转提示其促进线粒体应激适应。Nrf2与Sirt3可能形成相互强化的调控网络，而非两个孤立保护通路。体内结果提示Butein具有阶段特异性保护：早期代偿阶段主要减轻肥厚并恢复Nrf2相关抗氧化和线粒体应激适应通路，晚期病理阶段还改善心脏功能并减轻纤维化。Nrf2沉默和ML385抑制、Sirt3敲低提供了遗传和药理证据，支持Nrf2–Sirt3相关信号参与Butein保护作用；Sirt3敲低不影响Nrf2表达，提示Sirt3可能位于Nrf2相关信号下游。讨论同时指出，Butein是否直接与Keap1或Sirt3等通路组分发生分子互作尚未在本研究中实验验证，需进一步研究。局限性包括：Butein在TAC术前开始给药，属预防性而非治疗性范式；缺乏药理阳性对照；长期安全性和药代动力学未确定；仅使用雄性小鼠；直接分子互作未建立。研究结论翻译：总体而言，研究人员的发现表明，Butein通过协调的Nrf2–Sirt3信号恢复氧化还原平衡和线粒体稳态，从而减轻病理性心肌肥厚。Butein在体外和体内模型中均抑制肥厚性重构，在持续压力超负荷下改善心脏结构和功能，并在重构的早期代偿期和晚期病理阶段发挥阶段特异性心脏保护作用。这些发现支持靶向整合的氧化还原–线粒体应激通路以限制病理性心肌肥厚和心力衰竭进展的治疗潜力。