苹果耐盐调控新机制：MdVQ22-MdWRKY33d复合体通过活性氧清除调控MdPER55与MdDREB1D表达

《The Plant Journal》：The MdVQ22-MdWRKY33d complex regulates MdPER55 and MdDREB1D expression to modulate apple salt tolerance by reactive oxygen species scavenging

　　

苹果是全球重要的经济果树，具有可观的经济价值。然而，土壤盐渍化严重影响苹果的生长发育，导致产量和品质下降。由于嫁接苹果的耐盐性主要取决于砧木，本研究比较了盐胁迫下耐盐砧木（R5-5）和盐敏感砧木（M9T337）之间的转录组响应，鉴定到一个关键的盐响应基因MdWRKY33d。在苹果中过表达MdWRKY33d提高了耐盐性，而沉默该基因则产生相反效果。此外，在盐胁迫下，与对照相比，MdWRKY33d转基因苹果和杨树材料中叶绿素荧光值、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）水平均升高。功能分析表明，MdWRKY33d直接激活过氧化物酶55（MdPER55）和脱水响应元件结合蛋白1D（MdDREB1D）的表达，从而增强转基因植物的活性氧（ROS）清除能力和耐盐性。酵母双杂交筛选鉴定出MdVQ22为MdWRKY33d的互作蛋白，并通过pull-down、双分子荧光互补（BiFC）和荧光素酶互补成像（LCI）实验予以证实。MdVQ22通过抑制MdWRKY33d介导的MdPER55和MdDREB1D转录激活，负调控苹果耐盐性。综上所述，本研究探索了一个推测的调控模块MdVQ22-MdWRKY33d-MdPER55/MdDREB1D来协调苹果盐胁迫响应，并为培育耐盐品种提供了潜在靶点。

一、研究背景与科学问题

土壤盐渍化已成为全球性的重大环境问题。据联合国粮农组织（FAO）2024年数据，全球盐碱地面积约达13.81亿公顷，占世界土地总面积的10.7%。盐胁迫不仅严重制约苹果树的地理分布，还显著降低苹果产量和果实品质。盐胁迫诱导植物体内活性氧（ROS）过量产生，包括过氧化氢（H₂O₂）、超氧阴离子（O₂^?）和羟基自由基（HO·），过量积累的ROS对DNA、RNA、蛋白质和生物膜造成氧化损伤，破坏细胞稳态。植物为此进化出多层抗氧化防御系统，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等酶促抗氧化组分，以及抗坏血酸（AsA）、谷胱甘肽（GSH）和黄酮类化合物等非酶促组分。过氧化物酶（PRX）作为ROS清除的核心酶类，在植物耐盐胁迫中发挥关键作用。脱水响应元件结合蛋白（DREB）属于AP2/ERF超家族，通过特异性结合下游胁迫响应基因启动子中的DRE顺式作用元件来调控其表达。由于苹果主要通过嫁接繁殖，其抗逆性在很大程度上取决于砧木，而根系是盐胁迫等逆境条件最先影响的部位。因此，解析苹果耐盐的分子机制并开发耐盐品种/砧木对推进苹果产业发展至关重要。然而，目前关于VQ蛋白与WRKY转录因子形成的复合体如何调控木本植物非生物胁迫抗性的分子层面研究仍十分有限，在苹果中仅报道了MdWRKY75-MdVQ10模块通过反式激活MdSAG12和MdSAG18加速伤口诱导的叶片衰老。基于此，研究人员开展了本项研究。

二、研究内容与主要结论

本研究通过比较耐盐砧木R5-5与盐敏感砧木M9T337在盐胁迫下的转录组响应，鉴定出盐响应正调控因子MdWRKY33d。研究发现MdWRKY33d通过直接激活MdPER55和MdDREB1D的表达来增强ROS清除能力，从而提高苹果耐盐性。进一步通过酵母双杂交筛选鉴定出MdWRKY33d的互作蛋白MdVQ22，并证实MdVQ22通过抑制MdWRKY33d介导的转录激活功能负调控苹果耐盐性。该研究揭示了MdVQ22-MdWRKY33d-MdPER55/MdDREB1D模块协调苹果盐胁迫响应的分子机制，为培育耐盐苹果砧木提供了遗传资源和理论依据。

三、主要关键技术方法

研究人员利用加权基因共表达网络分析（WGCNA）分析耐盐（R5-5）和盐敏感（M9T337）砧木在150 mM NaCl处理0 h和48 h的根系RNA-Seq转录组数据。通过酵母双杂交（Y2H）筛选MdWRKY33d互作蛋白，并采用pull-down、双分子荧光互补（BiFC）和荧光素酶互补成像（LCI）验证蛋白互作。利用酵母单杂交（Y1H）、凝胶迁移率变动分析（EMSA）、双荧光素酶（Dual-LUC）报告基因实验和染色质免疫沉淀-qPCR（ChIP-qPCR）验证MdWRKY33d对下游靶基因的调控。通过农杆菌介导法获得苹果愈伤组织、苹果砧木瞬时转化材料和转基因杨树材料进行功能验证。

四、研究结果

1. 1.
   两个苹果砧木品种在盐胁迫下的表型和生理变化

在正常培养条件下两种砧木均生长良好，但盐胁迫不同程度抑制其生长。盐处理20天后，M9T337老叶黄化卷曲，表现出盐害症状，而R5-5不受影响。盐胁迫下R5-5的净光合速率（Pn）、气孔导度（g_s）和蒸腾速率（E）显著高于M9T337，胞间CO₂浓度（Ci）更低。R5-5根系表现出更大的根长、表面积、体积和活力，相对电导率和丙二醛（MDA）含量更低，叶片和根中Na⁺积累更少而K⁺积累更多，Na⁺/K⁺比值更低。这表明R5-5在盐胁迫下受损相对较轻，表现出更强的耐盐性和适应性。

1. 2.
   MdWRKY33d是苹果盐胁迫响应的正调控因子

WGCNA将差异表达基因（DEGs）聚类为九个模块，其中MEblue模块与SOD、POD、CAT活性和脯氨酸含量显著正相关。该模块中MD04G1167700和MD12G1181000在盐胁迫下于R5-5中显著上调，二者与拟南芥AtWRKY33亲缘关系最近，均属于WRKY-I亚家族。研究人员选择FPKM值更高的MD04G1167700命名为MdWRKY33d进行后续实验。qRT-PCR证实MdWRKY33d在R5-5中的表达水平在96小时盐胁迫处理期间显著高于M9T337。亚细胞定位实验证实MdWRKY33d定位于细胞核。

1. 3.
   MdWRKY33d增强转基因苹果清除ROS并维持光合系统稳定性

在M9T337苹果砧木中进行瞬时转化获得MdWRKY33d过表达（WRKY33d-OE）和沉默（TRV2-WRKY33d）材料。盐胁迫下WRKY33d-OE植株盐害症状较轻，MDA含量显著降低而脯氨酸含量显著升高；TRV2-WRKY33d植株则表现相反。DAB和NBT染色显示WRKY33d-OE株系ROS积累低于对照，TRV2-WRKY33d株系ROS水平高于对照。盐处理后WRKY33d-OE植株的SOD、POD和CAT活性显著高于对照，而TRV2-WRKY33d植株显著低于对照。叶绿素荧光成像显示WRKY33d-OE植株PSII完整性基本保持，TRV2-WRKY33d植株严重受损。WRKY33d-OE株系的F₀、Fm、Fv/Fm、Y(II)和Y(NPQ)值显著升高，Y(NO)降低。

1. 4.
   MdWRKY33d增强转基因杨树的耐盐性

获得过表达MdWRKY33d的转基因84K杨树株系（OE33d-2和OE33d-6）。150 mM NaCl处理50天后，野生型（WT）植株达到生理死亡状态，而转基因株系仅表现轻微萎蔫和少量落叶。转基因株系株高、根表面积、根体积、根分支数和根长均显著优于WT。盐胁迫下转基因株系相对电解质渗漏率（REL）和MDA含量显著降低，脯氨酸含量显著升高，H₂O₂和O₂^?积累减少，SOD、POD和CAT活性显著升高。转基因株系维持更高的F₀、Fm和Fv/Fm值，Y(II)和Y(NPQ)升高而Y(NO)降低。

1. 5.
   MdWRKY33d增强转基因苹果愈伤组织的ROS清除能力

获得MdWRKY33d-OE和MdWRKY33d-RNAi转基因苹果愈伤组织。150 mM NaCl处理下MdWRKY33d-OE愈伤组织生长显著优于WT，鲜重增加；MdWRKY33d-RNAi株系生长显著受抑。与WT相比，MdWRKY33d-OE愈伤组织MDA含量和电导率显著降低，脯氨酸积累显著升高，ROS水平降低，SOD、POD和CAT活性显著升高；MdWRKY33d-RNAi株系则表现相反趋势。

1. 6.
   MdWRKY33d结合MdDREB1D和MdPER55启动子激活其转录

对WT和MdWRKY33d-OE-7苹果愈伤组织盐胁迫后进行RNA-seq分析，发现过氧化物酶编码基因MdPER55在OE株系中表达显著升高。MdDREB1D在两种砧木盐胁迫转录组数据中与MdWRKY33d呈现相同表达趋势。qRT-PCR证实MdDREB1D和MdPER55在MdWRKY33d-OE株系中上调，在TRV-MdWRKY33d株系中受抑制。MdPER55和MdDREB1D启动子区域均含有W-box基序。Y1H、EMSA、Dual-LUC和ChIP-qPCR实验证实MdWRKY33d在体外和体内均能直接结合MdPER55和MdDREB1D启动子并激活其转录。MdDREB1D-OE和MdPER55-OE转基因苹果愈伤组织在盐胁迫下表现出显著增强的耐盐性，电解质渗漏率、H₂O₂和O₂^?含量显著降低。MdDREB1D-OE株系中MdPER55表达显著上调，但MdPER55启动子中未鉴定到DRE/CRT（CCGAC）基序，表明MdDREB1D可能通过中间调控因子间接调节MdPER55表达。

1. 7.
   MdVQ22在体外和体内与MdWRKY33d物理互作

由于全长MdWRKY33d在酵母中具有转录自激活活性，研究人员构建了N端截短变体进行Y2H筛选，最终选用pGBKT7-MdWRKY33d^(167–520)作为诱饵载体，从酵母文库中分离到含VQ基序的蛋白MdVQ22。MdVQ22的CDS为756 bp，编码251个氨基酸，含有保守结构域FxxhVQxhTG。亚细胞定位显示MdVQ22定位于细胞核，在根中表达量显著高于茎和叶。pull-down、BiFC和LCI实验均证实MdWRKY33d与MdVQ22在体内和体外存在物理互作。

1. 8.
   MdVQ22通过抑制MdWRKY33d的转录激活活性负调控苹果耐盐性

盐胁迫下MdVQ22和MdWRKY33d表达呈显著负相关。在盐敏感砧木M9T337中MdVQ22在整个96小时处理期间维持高表达；在耐盐砧木R5-5中，MdVQ22表达在盐胁迫6小时达到峰值后迅速回落至基础水平。OE-MdVQ22转基因苹果愈伤组织在盐胁迫下生长抑制更严重、鲜重显著降低；TRV2-VQ22苹果植株盐害症状较轻，ROS含量降低，SOD、POD和CAT活性显著升高。OE-MdVQ22株系中MdPER55和MdDREB1D表达显著降低，TRV2-VQ22株系中表达显著升高。EMSA实验显示MdVQ22显著减弱MdWRKY33d与MdPER55和MdDREB1D启动子的结合；ChIP-qPCR证实MdVQ22抑制MdWRKY33d在这些启动子W-box位点的富集；Dual-LUC实验表明MdVQ22与MdWRKY33d共表达显著下调MdPER55/MdDREB1D的转录水平。在OE-MdVQ22-1背景中共过表达MdWRKY33d可部分挽救其盐敏感表型。此外，杨树中PtVQ22、PtWRKY33、PtPER55和PtDREB1的核心功能域与苹果高度保守，Y2H证实PtVQ22与PtWRKY33存在物理互作，异源过表达MdWRKY33d的杨树中内源PtPER55和PtDREB1显著上调，表明VQ22-WRKY33d-PER55/DREB1调控关系在苹果和杨树间可能保守。

五、讨论与结论

本研究发现MdWRKY33d通过激活抗氧化酶系统和优化光合系统提高转基因杨树和苹果的耐盐性。MdWRKY33d直接结合MdDREB1D和MdPER55启动子中的W-box基序并激活其转录，从而增强ROS清除能力。MdVQ22作为MdWRKY33d的互作蛋白，通过形成抑制性复合物阻碍MdWRKY33d向耐盐基因启动子的招募，负调控苹果耐盐性。在耐盐砧木R5-5中MdVQ22的快速衰减可能是激活盐防御机制的前提，而敏感基因型无法下调MdVQ22导致胁迫响应持续受抑。MdPER55在MdDREB1D-OE株系中显著上调，表明其位于MdDREB1D下游，但MdPER55启动子中缺乏典型DRE/CRT基序，提示MdDREB1D可能通过非典型结合位点或间接方式调控MdPER55。本研究揭示了MdVQ22-MdWRKY33d-MdPER55/MdDREB1D模块协调苹果盐胁迫响应的分子机制，为深入理解苹果盐胁迫响应的分子机制提供了新视角，也为培育抗性苹果品种提供了潜在分子靶点。