《The Plant Journal》：MdMPK6a/b-mediated phosphorylation of MdANN2 restricts cytosolic Ca2+ influx and attenuates cold tolerance in apple
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膜联蛋白（Annexins, ANNs）是Ca2?依赖性磷脂结合蛋白，在植物响应环境胁迫中发挥重要作用。然而，苹果（apple）ANN基因家族及其参与冷胁迫响应的调控机制仍不清楚。本研究在苹果基因组中鉴定出15个MdANN家族成员，分为三个亚家族。其中，MdA
膜联蛋白（Annexins, ANNs）是Ca2?依赖性磷脂结合蛋白，在植物响应环境胁迫中发挥重要作用。然而，苹果（apple）ANN基因家族及其参与冷胁迫响应的调控机制仍不清楚。本研究在苹果基因组中鉴定出15个MdANN家族成员，分为三个亚家族。其中，MdANN2的表达受低温强烈诱导。功能分析表明，过表达MdANN2显著增强了苹果的耐寒性，而病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）抑制MdANN2则降低了耐寒性。亚细胞定位显示MdANN2定位于质膜、细胞质和细胞核。非损伤微测技术（non-invasive micro-test technology, NMT）进一步揭示MdANN2与Ca2?通透性通道活性相关：冷刺激显著增强了MdANN2过表达植株中的胞质Ca2?内流，而外源施加Ca2?通道阻断剂LaCl?或Ca2?螯合剂EGTA则显著抑制了该内流。激酶MdMPK6a和MdMPK6b在体外和体内均与MdANN2物理相互作用并使其磷酸化。沉默MdMPK6a/b显著提高了苹果的耐寒性，而过表达MdMPK6a/b则降低了耐寒性。此外，在MdANN2过表达背景下瞬时过表达MdMPK6a/b减弱了MdANN2介导的耐寒性和Ca2?内流。同时，共定位实验显示MdMPK6a/b减少了MdANN2在质膜的积累。综上所述，这些发现表明MdANN2通过促进冷诱导的Ca2?内流正向调控苹果耐寒性，而这一过程受到MdMPK6a/b介导的磷酸化的抑制。本研究鉴定了一个新的MdMPK6a/b-MdANN2模块，该模块在冷胁迫下调控苹果中的Ca2?信号，从而为提高苹果及其他作物物种的耐寒性提供了有前景的分子靶点。
一、研究背景与科学问题
全球气候变化加剧了极端温度的不可预测性和严重性，低温胁迫（cold stress）是限制农业生产的主要环境因素之一。对于多年生木本果树苹果而言，春季晚霜冻害会损害花芽、降低果实品质并造成重大经济损失。植物作为固着生物，进化出了复杂的机制来感知和响应低温。温度下降首先被质膜流动性变化感知，并触发胞质Ca2?浓度瞬时升高，这一Ca2?信号随后通过磷酸化级联反应传递至下游转录调控因子，最终激活CBF/DREB1及下游冷响应（COR）基因的表达。
膜联蛋白（Annexins, ANNs）是一类Ca2?依赖性磷脂结合蛋白，可作为Ca2?通透性通道参与胞内外Ca2?稳态的维持。已有研究表明ANNs在多种植物的非生物胁迫响应中发挥作用，例如拟南芥AtANN1介导活性氧（ROS）和盐胁迫诱导的胞质Ca2?升高，玉米ZmANN33和ZmANN35异源表达增强拟南芥耐寒性。然而，苹果中ANN基因家族及其在冷胁迫响应中的功能尚不明确。
翻译后修饰，特别是磷酸化，可精细调控离子转运蛋白的活性、稳定性和亚细胞定位。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）级联是植物冷信号传导的核心组成部分。在拟南芥中，MKK4/5-MPK3/6级联通过磷酸化ICE1负调控耐寒性，而MEKK1-MKK2-MPK4级联则正调控耐寒性。尽管已知MPKs可直接磷酸化多种功能性蛋白，但MPKs是否直接磷酸化Ca2?通道以调控植物冷胁迫响应仍不清楚。
基于此，研究人员开展了此项研究，旨在系统鉴定苹果ANN基因家族，阐明其成员在冷胁迫响应中的功能，并探索上游激酶对其活性的调控机制。
二、主要关键技术方法
研究人员采用了以下关键技术：1）利用HMMER筛选和BLAST比对进行全基因组鉴定，并结合MEGA7软件构建最大似然法系统发育树；2）通过农杆菌介导法转化苹果‘GL-3’（源于‘Royal Gala’）植株获得稳定转基因材料，并采用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术进行功能缺失分析；3）运用酵母双杂交（Y2H）、荧光素酶互补（split-LUC）、双分子荧光互补（BiFC）及体外Pull-down实验验证蛋白互作；4）通过Phos-tag凝胶电泳和抗磷酸化抗体免疫印迹进行体内外磷酸化检测；5）利用非损伤微测技术（NMT）实时测定叶片细胞Ca2?流；6）通过共聚焦显微镜观察和膜蛋白分离免疫印迹分析蛋白亚细胞定位变化。
三、研究结果
1. 苹果MdANN基因家族的全基因组鉴定、生物信息学分析及冷诱导表达谱
研究人员从苹果基因组中鉴定出15个MdANN基因，分布于9条染色体，包含3对串联重复和3对片段重复。系统发育分析将其分为三个亚家族。冷处理（4℃）后，多个MdANN基因被诱导，其中MdANN2的转录响应最强（2小时上升超7倍），因此被选为后续功能研究的代表。亚细胞定位显示MdANN2定位于质膜、细胞质和细胞核。
2. MdANN2正向调控苹果耐寒性
冷冻处理后，MdANN2过表达（OE）株系相比野生型（WT）表现出更轻的叶片损伤、更高的存活率和更低的相对电解质泄漏，同时积累了更少的H?O?和O??·，并具有更高的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性。相反，VIGS沉默MdANN2的植株冷冻后损伤更重，存活率更低，ROS积累更多，抗氧化酶活性更低。
3. MdANN2促进冷诱导的Ca2?内流及冷响应基因表达
NMT测量显示，冷刺激迅速诱导胞质Ca2?内流，MdANN2-OE株系的Ca2?内流速率和峰值均显著高于WT，而Ca2?通道阻断剂LaCl?或螯合剂EGTA可显著抑制此内流。冷处理后，MdANN2-OE株系中MdCBF1/3、MdCOR15A、MdCOR47及抗氧化酶编码基因MdFSD2和MdPRXR1.1的表达水平显著高于WT。
4. MdMPK6a和MdMPK6b与MdANN2互作并使其磷酸化
Y2H筛选以MdANN2为诱饵鉴定到MdMPK6a。Y2H、split-LUC、BiFC和Pull-down实验证实MdMPK6a及其高度同源物MdMPK6b均与MdANN2在体内和体外发生物理互作。体外激酶实验和体内磷酸化实验证明MdMPK6a/b可直接磷酸化MdANN2，且冷胁迫增强了该磷酸化水平。
5. MdMPK6a/b负调控苹果耐寒性
VIGS沉默MdMPK6a/b后，植株冷冻后叶片损伤更轻，存活率更高，离子泄漏和ROS积累更低，抗氧化酶活性更高。相反，瞬时过表达MdMPK6a或MdMPK6b的植株冷冻后损伤更重，耐寒性降低。
6. 过表达MdMPK6a/b抑制MdANN2介导的耐寒性
在MdANN2-OE#3背景上分别瞬时过表达MdMPK6a或MdMPK6b后，双转基因植株虽仍比WT耐寒，但其存活率、ROS水平和抗氧化酶活性等指标均显著劣于单独的MdANN2-OE#3植株，表明MdMPK6a/b削弱了MdANN2介导的耐寒性。
7. MdMPK6a/b抑制MdANN2介导的Ca2?内流和冷响应
NMT测量显示，在MdANN2-OE背景上过表达MdMPK6a或MdMPK6b后，冷诱导的Ca2?内流速率和峰值均显著低于单独MdANN2-OE植株。同时，MdANN2-OE对COR基因的诱导上调作用也被MdMPK6a/b过表达所抑制。
8. MdMPK6a/b减少MdANN2在质膜的积累
在本氏烟中共表达实验中，MdMPK6a/b显著降低了MdANN2-GFP与质膜标记AtCBL1-mCherry的共定位信号。膜蛋白和胞质蛋白分离后的免疫印迹分析进一步证实，MdMPK6a/b共表达导致MdANN2在膜组分中丰度降低，而在胞质组分中丰度增加。
四、总结与讨论
本研究首次系统鉴定了苹果15个MdANN家族成员，并证实MdANN2是一个冷响应基因，通过促进冷诱导的胞质Ca2?内流正向调控苹果耐寒性。该过程激活了下游CBF-COR通路并增强了抗氧化防御能力。更重要的是，研究发现激酶MdMPK6a和MdMPK6b作为MdANN2的互作蛋白，通过直接磷酸化MdANN2，减少其在质膜的积累，从而抑制Ca2?内流和下游冷响应基因表达，最终负向调控耐寒性。
研究结论部分翻译如下：整合已发表数据和本研究发现，研究人员提出了一个调控模块，即MdMPK6a/b与MdANN2互作以精细调控冷诱导的Ca2?信号，进而调节苹果的冷响应。冷感知诱导MdANN2表达并促进其在质膜积累，MdANN2作为Ca2?通透性组分介导Ca2?内流，产生胞质Ca2?信号，激活CBF依赖的冷响应转录并增强抗氧化防御。MdMPK6a/b与MdANN2互作并使其磷酸化，导致MdANN2在质膜积累减少，Ca2?内流减弱，从而抑制CBF和COR基因表达，削弱细胞对冷胁迫的耐受性。通过该模块，苹果细胞可能精细调控早期Ca2?信号的幅度和持续时间，从而平衡有效的防御激活与离子稳态的维持。这些发现确定了一个此前未知的MdMPK6a/b-MdANN2冷信号模块，并为多年生果树耐寒性的遗传改良提供了潜在的靶点。
