基于计算优化的EtAMA1抗原作为鸡柔嫩艾美耳球虫疫苗候选的潜力评估

《Veterinary Medicine and Science》：Computational Optimisation of EtAMA1 Reveals Its Potential as a Vaccine Candidate Against Eimeria tenella

　　

柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）是感染鸡的最具致病性的艾美耳属（Eimeria）物种之一；因此，球虫病（coccidiosis）仍是全球家禽业经济损失最严重的疾病之一，其原因是生长性能下降、饲料转化率降低、肠道病理损伤及死亡率升高。传统的防控措施，包括化疗药物和活弱毒疫苗，由于耐药性、药物残留、安全性问题及高生产成本而日益受限，促使研究人员关注替代策略，如顶膜抗原1（apical membrane antigen-1，AMA1）——一种在宿主细胞入侵中起关键作用的保守且高度免疫原性的微线体蛋白（microneme protein）。此前在疟原虫（Plasmodium）、弓形虫（Toxoplasma）和巴贝虫（Babesia）中的研究已证明AMA1在重组疫苗和免疫信息学设计疫苗中的成功应用，凸显其作为跨物种亚单位疫苗候选的潜力。本研究探索了柔嫩艾美耳球虫AMA1（EtAMA1），旨在研究其理化及结构特性，利用免疫信息学工具鉴定抗原性T细胞和B细胞表位，并评估EtAMA1在宿主体内诱导免疫应答的有效性。结构分析显示z-score为?6.86，拉马钱德兰图（Ramachandran plot）为97.19%。EtAMA1包含3个CD8+、7个CD4+ T细胞表位、1个线性及8个不连续B细胞表位。通过计算机模拟免疫应答评估了EtAMA1诱导免疫应答的能力。分子对接和分子动力学模拟产生的结合相互作用能表明EtAMA1与Toll样受体5（Toll-like receptor 5，TLR5）之间存在强结合相互作用。结果表明EtAMA1是一个有前景的疫苗候选抗原；然而，仍需实验验证。

论文解读：基于免疫信息学与分子模拟的EtAMA1作为鸡柔嫩艾美耳球虫疫苗候选抗原的综合评估

一、研究背景与意义

鸡球虫病是由艾美耳属（Eimeria）原生动物寄生虫引起的肠道疾病，是全球家禽业面临的主要威胁之一，造成生长性能下降、饲料转化效率降低、肠道损伤和死亡率升高等重大经济损失。传统防控手段包括化学治疗药物和活弱毒疫苗，但耐药性的出现、药物残留问题、活疫苗安全性隐患、生产成本高以及针对多种致病性艾美耳物种的多价疫苗复杂性，使这些策略面临日益严峻的局限。在此背景下，顶膜抗原1（AMA1）作为一种在顶复门（Apicomplexa）寄生虫中高度保守的微线体蛋白，在宿主细胞入侵过程中被转运至虫体表面并发挥关键作用，成为亚单位疫苗开发的重要靶标。已有研究在恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）和牛巴贝虫（Babesia bovis）中证实了AMA1在重组疫苗和免疫信息学设计多表位疫苗中的应用价值。针对柔嫩艾美耳球虫，其AMA1（EtAMA1）基因全长2349 bp，开放阅读框1608 bp，编码535个氨基酸的蛋白，且在子孢子阶段表达最强。研究表明针对子孢子的重组EtAMA1（rEtAMA1）可将寄生虫入侵能力抑制约70%，凸显其功能相关性。然而，艾美耳属复杂的生命周期和抗原多样性，加之疫苗开发资源消耗大，使得亚单位疫苗的高效设计面临巨大挑战。免疫信息学工具整合计算生物学、结构预测、表位作图和免疫原性评估，为合理设计优先靶向最具抗原性决定簇的疫苗提供了可行方案，同时可降低成本和实验程序。

二、主要技术方法

研究人员从NCBI数据库获取EtAMA1蛋白序列（AEJ33058.1），经BlastP搜索筛选显著E值（0.0）和高度同源序列（≥90%一致性），通过MAFFT进行多序列比对并利用Jalview构建共有序列。研究采用多种生物信息学工具：VaxiJen 2.0预测抗原性，AllergenFP 1.0和AlgPred评估致敏性，Protein-Sol预测溶解度，ProtParam分析理化性质；TMHMM 2.0和PSORT II预测跨膜结构域和亚细胞定位；NetNGlyc、NetOGlyc、NetPhos和GPS-PAIL预测翻译后修饰位点；GOR IV分析二级结构；SWISS-MODEL进行同源建模，GalaxyRefine进行结构优化，并通过拉马钱德兰图和ProSA-web验证模型质量。T细胞表位预测方面，研究人员以人类HLA等位基因替代鸡MHC进行预测（因现有免疫信息学工具缺乏鸡等位基因数据），利用NetCTL 1.2和IEDB MHC-I工具预测CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞表位，IEDB MHC-II工具预测CD4⁺辅助T淋巴细胞表位，并通过IFNepitope和IL4pred筛选细胞因子诱导能力。B细胞表位通过ABCpred预测线性表位，ElliPro预测不连续表位。免疫应答模拟采用C-IMMSIM工具，分子对接使用HDOCK服务器，分子动力学模拟采用AMBER软件包（FF14SB力场，TIP3P水模型，230 ns生产运行），结合MM/GBSA计算结合自由能，并利用PTRAJ/CPPTRAJ模块分析RMSD、RMSF、SASA和氢键数量，Bio3D包进行主成分分析和动态交叉相关分析。

三、研究结果

3.1 致敏性、抗原性、溶解度及理化特性

AllergenFP 1.0和AlgPred结果均显示EtAMA1为非致敏原，VaxiJen抗原性评分为0.6773，表明具有良好的抗原性潜力。Protein-Sol预测的可溶性评分为0.327。ProtParam分析显示：蛋白长度536个氨基酸，分子量58.02 kDa，等电点（pI）5.79（偏酸性），N端为甲硫氨酸，在哺乳动物网织红细胞中半衰期约30小时（体外）、酵母中20小时（体内）、大肠杆菌中10小时（体内）。不稳定指数为53.53（>40，表明蛋白不稳定），GRAVY值为?0.413（亲水性），脂肪族指数66.34（较高，提示热稳定性）。负电荷残基（Asp+Glu）61个，正电荷残基（Arg+Lys）53个，净电荷为负。

3.2 亚细胞定位、跨膜结构域、翻译后修饰及二级和三维结构

TMHMM结果显示EtAMA1存在单一跨膜结构域。PSORT II预测亚细胞定位主要为细胞质（26.1%）、细胞核（21.7%）和线粒体（13.0%）。翻译后修饰预测显示无N-糖基化位点，10个O-糖基化位点，52个磷酸化位点（Ser-30、Thr-14、Tyr-8）和4个乙酰化位点。GOR IV二级结构分析显示随机卷曲（59.14%）占比最高，其次为α螺旋（29.29%）和延伸链（11.57%）。SWISS-MODEL同源建模显示模板覆盖率为1.00，序列一致性99.63%。

3.3 三维模型优化与验证

GalaxyRefine优化后，拉马钱德兰图中位于 favored 区域的残基比例从优化前的86.07%提升至97.19%，ProSA z-score从?6.4改善至?6.86，表明优化后的三维结构质量显著提高。

3.4 抗原肽预测

经多序列比对、抗原性测试、跨膜拓扑分析和致敏性筛选，最终获得5个位于膜外且为非致敏原的抗原肽段（P1–P5），长度58–60个氨基酸，抗原性评分0.6379–1.0915。相似性搜索表明这些肽段在其他艾美耳物种中存在保守性，提示潜在的交叉保护能力。

3.5 CD8⁺ T细胞表位预测

从34个抗原性表位中，经免疫原性、保守性和致敏性筛选，最终获得3个非致敏性CD8⁺ CTL表位：KNIEFYQPL（HLA-A32:01，IC₅₀=170.58，抗原性1.0250）、RPGYYFPSI（HLA-B07:02和HLA-B08:01，IC₅₀=85.88和232.03，抗原性0.7029）和SPGYYFPSI（HLA-B08:01和HLA-B*07:02，IC₅₀=148.10和185.31，抗原性0.6288）。

3.6 CD4⁺ T细胞表位预测

从46个抗原性表位中，经保守性、IFN-γ和IL-4诱导能力及致敏性筛选，最终获得7个非致敏性CD4⁺ HTL表位，包括GGVGVNFASYYPSGE（HLA-DRB1 * 04:05）、VFGKNIEFYQPLDSD（HLA-DRB1 * 04:04）以及多个结合HLA-DRB1 * 04:01的含RPGYYFPSI核心序列的表位，IC₅₀值137–193，抗原性评分0.5932–0.9822。

3.7 线性与不连续B细胞表位预测

ABCpred预测32个B细胞表位，经抗原性、致敏性和保守性筛选后，仅1个线性B细胞表位DEAATSPGYYFPSITP通过所有阈值（ABCpred评分0.84，VaxiJen评分0.7794，保守性100%，非致敏原）。ElliPro基于优化后的三维结构预测出8个不连续B细胞表位，这些表位是天然功能蛋白上抗体识别和结合的主要位点。

3.8 计算机模拟免疫应答

C-IMMSIM模拟显示，三次给药后免疫球蛋白（IgM+IgG、IgM、IgG1+IgG2、IgG1和IgG2）水平逐步升高，B细胞密度增加，记忆细胞显著增多，抗原浓度相应下降。T细胞（辅助性T细胞和细胞毒性T细胞）群体在每次抗原暴露后均增加并形成记忆。模拟结果证实EtAMA1能够在体内触发有效的免疫应答。

3.9 分子对接与分子动力学模拟

HDOCK分子对接获得的最佳模型结合亲和力为?243.77 kcal/mol。230 ns分子动力学模拟后，MM/GBSA计算的结合自由能（?G_bind）为?104.73 kcal/mol，其中范德华能?247.41 kcal/mol，静电贡献?375.38 kcal/mol，极性溶剂化能551.06 kcal/mol，非极性溶剂化能?33.00 kcal/mol。残基分解能量分析显示EtAMA1侧贡献最大的残基为TYR 452（?6.476 kcal/mol）和THR 250（?4.577 kcal/mol），TLR5侧贡献最大的残基为TYR 459（?6.306 kcal/mol）和ARG 466（?5.510 kcal/mol）。RMSD结果显示复合物最大波动3.73 ?，在200–230 ns区间稳定于约3.1 ?，表明复合物具有良好的结构稳定性。SASA分析显示结合后可用溶剂可及面积较低，表明界面残基紧密接触。复合物中氢键数量显著高于未结合状态。主成分分析显示前20个主成分解释了69.2%的构象波动方差（PC1=20.63%，PC2=9.58%，PC3=7.79%）。动态交叉相关分析表明TLR5残基比EtAMA1残基具有更高的正相关性。

四、讨论与结论

讨论部分指出，EtAMA1的免疫原性（0.6773）和非致敏性是疫苗候选抗原的基本特征；58.02 kDa的分子量足以容纳多个潜在表位并刺激免疫应答；负GRAVY值表明蛋白亲水性区域表面暴露，有利于免疫系统识别；高脂肪族指数提示蛋白热稳定性；单一跨膜结构域证实其作为膜蛋白与细胞内、外环境相互作用的关键特性。翻译后修饰位点可能参与调控蛋白功能与活性。二级结构中高比例随机卷曲提供良好结构基础，α螺旋贡献结构稳定性。优化后的三维结构z-score和拉马钱德兰图均表明模型质量良好。膜外表位是病原与宿主免疫系统接触的主要位点，增强免疫原性和物种间保守性。预测的T细胞表位中，CD4⁺表位同时具备IFN-γ（Th1细胞免疫）和IL-4（Th2体液免疫）诱导能力，对实现长效免疫至关重要。不连续B细胞表位是天然功能蛋白上抗体识别的主要位点。TLR5作为在Eimeria感染鸡盲肠巨噬细胞中上调的模式识别受体，其与EtAMA1的强结合相互作用（?104.73 kcal/mol）进一步支持该抗原诱导先天免疫应答的能力，RMSD、RMSF、SASA和氢键分析共同验证了复合物的稳定性和显著相互作用。

研究结论：本研究成功利用免疫信息学工具探究了EtAMA1的理化与结构特性，并鉴定了抗原性T细胞和B细胞表位。计算结果表明EtAMA1满足疫苗候选抗原的关键标准，具备抗原性、非致敏性、免疫原性和稳定性特征，免疫模拟分析显示其能通过细胞因子产生诱导强健免疫应答。分子对接和分子动力学模拟进一步证实EtAMA1与TLR5的强结合亲和力和稳定相互作用。尽管研究结果为EtAMA1作为疫苗候选提供了有前景的依据，但聚焦于蛋白特定免疫原性区域而非全蛋白可能更具效果，以降低寄生虫抗原复杂性。建议开展实验室验证以确认计算结果。总体而言，该研究为开发针对艾美耳球虫的疫苗奠定了良好基础。