《Veterinary Medicine International》：Associated Proteins’ Proteomic Profiling of Equine Periodontal Ligament Stem Cell–Derived Exosomes for Diabetic Wound Healing Regeneration
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背景与目的：以外泌体为基础的无细胞疗法已显示出增强糖尿病溃疡愈合的巨大潜力。来源于马牙周膜干细胞（ePDLSCs）的外泌体为再生性创面愈合治疗提供了一种可行的替代方案。本研究旨在表征和分析这些外泌体的蛋白质组成，并评估其在体内治疗糖尿病创面的有效性。
材料与
背景与目的：以外泌体为基础的无细胞疗法已显示出增强糖尿病溃疡愈合的巨大潜力。来源于马牙周膜干细胞（ePDLSCs）的外泌体为再生性创面愈合治疗提供了一种可行的替代方案。本研究旨在表征和分析这些外泌体的蛋白质组成，并评估其在体内治疗糖尿病创面的有效性。
材料与方法：本研究采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）分离并表征ePDLSCs-外泌体；对ePDLSCs-外泌体进行蛋白质印迹分析；使用高分辨率质谱（HRMS）对ePDLSCs-外泌体进行蛋白质组学分析；对ACTB和VIM进行蛋白质印迹分析；利用与创面愈合相关的蛋白质组学分析数据进行潜在蛋白质分析（Reactome、基因本体[GO]、KEGG通路分析）；并评估ePDLSCs-外泌体凝胶对糖尿病溃疡创面体内愈合的影响。
结果：本研究结果揭示，ePDLSCs来源的外泌体，经NTA显示，粒径分布约为114±39nm，并表达外泌体表面标志物CD9。ePDLSCs-Exo含有35种可能参与创面愈合的蛋白质，其中最大的肽谱匹配数（PSMs）为膜联蛋白2（ANXA2）、β-肌动蛋白（ACTB）和波形蛋白（VIM），如蛋白质印迹分析所示。功能富集分析揭示了从ePDLSCs-Exo中鉴定出的支持创面愈合的蛋白质的潜在生物学意义和信号通路。此外，体内实验显示ePDLSCs-外泌体影响糖尿病创面愈合，外泌体治疗组的愈合率更高。
结论：ePDLSCs来源的外泌体已显示出再生和愈合特性，特别是在与糖尿病相关的组织损伤背景下。
糖尿病创面愈合是一个复杂的病理生理过程，长期高血糖导致炎症期延长，M1型巨噬细胞（促炎型）持续极化，使创面难以进入增殖和重塑阶段，是临床面临的重大挑战。间充质干细胞（MSCs）疗法虽具有再生潜力，但在体外培养中存在增殖与分化能力降低等局限。外泌体（Exosomes）作为MSCs旁分泌的关键介质，具有低免疫原性、高稳定性和可规模化生产等优势，已成为无细胞治疗的研究热点。马牙周膜干细胞（ePDLSCs）是一种易于获取的牙源性干细胞，其外泌体可能富含多种组织修复相关蛋白。本研究旨在通过蛋白质组学技术解析ePDLSCs外泌体的蛋白组分，并通过体内实验评估其对糖尿病创面愈合的促进作用。研究人员成功分离并表征了ePDLSCs-Exo，利用高分辨率质谱（HRMS）鉴定出多个与创面愈合相关的蛋白，并在糖尿病大鼠模型中证实其能显著加速创面闭合。这些发现为糖尿病创面治疗提供了一种有前景的无细胞策略，具有重要的转化医学意义。
研究人员采用组织外植法从马牙周膜分离ePDLSCs，培养至3-5代后收集条件培养基，使用商品化试剂盒提取外泌体。通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）和逆转录定量PCR（RT-qPCR）分别检测外泌体的粒径和标志物CD9。利用HRMS进行蛋白质组学分析，并结合Reactome、基因本体（GO）和KEGG通路富集分析筛选与创面愈合相关的蛋白及信号通路；通过蛋白质印迹（Western blot）验证关键蛋白ACTB和VIM。制备含ePDLSCs-Exo的凝胶并完成药学评价。在体内实验中，选取16只Wistar大鼠，随机分为4组（每组4只）：正常对照组（非糖尿病创面）、糖尿病基胶组、糖尿病商品药组和糖尿病ePDLSCs-Exo凝胶组。通过腹腔注射链脲佐菌素（STZ）/烟酰胺（NA）诱导糖尿病，建立背部6mm全层皮肤创面，每日给药并观察14天。通过创面闭合率、激光散斑成像和组织病理学分析评估疗效。
3.1 ePDLSCs-外泌体的制备与表征：NTA显示外泌体粒径分布于30-200nm，平均直径为114±39nm，RT-qPCR检测到外泌体表面标志物CD9，证实了外泌体的成功分离。
3.2 ePDLSCs-外泌体的蛋白质组学分析：HRMS共鉴定出35个与创面愈合可能相关的蛋白质，其中膜联蛋白2（ANXA2）、β-肌动蛋白（ACTB）和波形蛋白（VIM）的肽谱匹配数最高。Western blot进一步验证了ACTB（约42kDa）和VIM（约55kDa）的表达。
3.3 蛋白质组学在创面愈合阶段的作用：Reactome数据库分析显示，ePDLSCs-Exo中的蛋白富集于细胞外基质（ECM）组织、细胞因子信号、血管内皮生长因子（VEGF）信号和血小板衍生生长因子（PDGF）信号等通路；GO富集分析显示生物学过程包括创面愈合、皮肤发育、组织发育和角质形成细胞分化；KEGG通路分析显示显著富集于ECM-受体相互作用、局灶黏附、PI3K-Akt信号通路、血小板活化、补体与凝血级联以及蛋白质消化吸收通路。这些结果表明外泌体蛋白可覆盖创面愈合的止血、炎症、增殖和重塑各个阶段。
3.4 ePDLSCs-外泌体凝胶对糖尿病创面愈合的评价：体内实验显示，ePDLSCs-Exo凝胶组第14天创面闭合率为98.81%±0.023，显著高于糖尿病基胶组；激光散斑成像显示治疗组创面与正常组织的灌注差值（ΔPU）为?55.59，小于其他糖尿病组，表明其能有效改善创面血流灌注，促进新生血管形成。
3.5 创面愈合评估中的组织病理学分析：组织病理学显示，ePDLSCs-Exo组再上皮化最完全，上皮厚度最大；炎性细胞（中性粒细胞和巨噬细胞）浸润评分显著低于其他组；成纤维细胞和肌成纤维细胞样细胞密度显著增加；微血管数量增多且血管腔较大、壁较厚，提示外泌体促进了创面由炎症期向增殖期和重塑期的转变。
讨论部分总结：ePDLSCs-Exo中高丰度的ANXA2、ACTB和VIM参与细胞迁移和细胞骨架重塑，促进再上皮化；功能富集分析显示的补体与凝血级联、急性期反应和中性粒细胞相关通路与组织病理学中炎症浸润减少一致，研究人员提出外泌体可能通过调节巨噬细胞从M1向M2极化来减轻炎症；ECM-受体相互作用和局灶黏附通路支持成纤维细胞迁移和ECM重塑；VEGF和PDGF信号通路分别促进血管成熟和成纤维细胞募集。此外，纤维蛋白原（FGA、FGB、FGG）参与止血期，胶原蛋白（COL1A1、COL3A1、COL6A1）等参与瘢痕组织形成。研究人员认为，ePDLSCs-Exo通过多种蛋白质协同作用，促进糖尿病创面愈合。
研究人员得出的结论是：这些发现与ePDLSCs-Exo具有再生特性并能改善糖尿病创面受损愈合环境的证据一致。它们可能通过促进血管生成、调节炎症和支持ECM沉积来恢复组织降解与再生之间的平衡。这些特征表明ePDLSCs-Exo可能作为旁分泌因子，提供干细胞治疗的益处而无直接移植风险。尽管需要进一步的分子研究来阐明信号机制，但研究结果证明了ePDLSCs来源的外泌体作为糖尿病创面无细胞疗法的潜力。
