四跨膜蛋白E促进家蚕核型多角体病毒的增殖，这可能是通过与病毒包膜蛋白相互作用并参与内吞和细胞凋亡的调控而实现的

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Tetraspanin E promotes the proliferation of B. mori nucleopolyhedrovirus, probably by interacting with the viral envelope protein and involvement in the regulation of endocytosis and apoptosis

　　

# 摘要

四跨膜蛋白属于跨膜4超家族（TM4SF），通过彼此之间或与伴侣蛋白的相互作用，形成庞大的富含四跨膜蛋白的微区（TEMs）调控网络。此外，四跨膜蛋白在细胞外受体识别、细胞内信号传导、病毒黏附和膜融合等重要生理过程中发挥关键作用。本研究发现，家蚕（Bombyx mori）中的一种四跨膜蛋白基因——家蚕四跨膜蛋白E（BmTsp E），在家蚕杆状核型多角体病毒（BmNPV）感染后显著上调表达，且在敏感与抗性家蚕品系之间表现出极为显著的差异表达。功能获得和功能缺失实验，结合抗体阻断和重组蛋白注射实验，表明BmTsp E能够增强BmNPV的增殖。机制上，BmTsp E与关键病毒包膜糖蛋白GP64相互作用，在病毒暴露后促进内吞作用，同时BmTsp E还抑制了细胞凋亡信号通路，从而产生有利于病毒增殖的细胞内状态。总体而言，这些发现表明BmTsp E似乎作为一种促病毒宿主因子，既能介导依赖于GP64的病毒进入，又能逃避凋亡，从而为深入了解BmNPV与家蚕相互作用机制提供了新见解。

# 引言

四跨膜蛋白属于被称为质膜"主控组织者"的跨膜糖蛋白家族，参与多种类型的细胞过程（Lang and Hochheimer, 2020）。在结构上，四跨膜蛋白由四个跨膜结构域（标记为TM1至TM4）、一个大的胞外环（LEL）、一个小的胞外环（SEL）和一个胞内环（IL）组成。其中，LEL结构域含有一个高度保守的"半胱氨酸-半胱氨酸-甘氨酸"（CCG）基序和三个保守的半胱氨酸残基，其中包含了几乎已知的四跨膜蛋白所有蛋白质-蛋白质相互作用位点（Hantak等, 2019）。作为一类进化上保守的跨膜蛋白，四跨膜蛋白充当胞内和胞外信号之间的"门户"，对胞外受体识别、胞内信号传导以及促进信号网络中与结合伙伴的相互作用至关重要（Robert等, 2021）。此外，由于四跨膜蛋白具有特殊的结构和多样的功能，它们在病毒与宿主之间的"相互作用"中扮演着关键角色，如病毒识别与进入、合胞体形成和病毒颗粒释放等（Hantak等, 2019）。在病毒与宿主相互对抗的过程中，特定的四跨膜蛋白选择性地与特定病毒相互作用，并影响病毒感染的多个阶段（Martin等, 2005）。例如，在中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）中，抗体阻断FcTetraspanin-3可显著降低感染白斑综合征病毒（WSSV）的虾的死亡率，而FcTetraspanin-3的RNAi沉默则大幅降低病毒拷贝数，表明FcTetraspanin-3可能在介导WSSV侵入细胞中发挥重要作用（Gui等, 2012）。此外，埃及伊蚊（Aedes aegypti）Tsp29Fb与登革热病毒2型（DENV2）的E蛋白直接相互作用，而RNAi和抗体阻断则导致细胞内和细胞外囊泡中的DENV2减少（Vora等, 2018）。

四跨膜蛋白的特殊结构使其能够与特定伴侣蛋白或其他四跨膜蛋白结合，形成富含四跨膜蛋白的微区（TEMs），这些微区在免疫系统、肿瘤等领域调控细胞形态、运动、融合和信号传导功能（Hemler, 2005；Yá?ez-Mó等, 2009）。例如，人类四跨膜蛋白CD151与β1/β3整合素相互作用，后者是人类巨细胞病毒（HCMV）可能的膜受体，通过质膜或内化囊泡内的膜融合促进HCMV进入内皮细胞（Hochdorfer等, 2016）。在斜纹夜蛾（Manduca sexta）中，四跨膜蛋白D76与伴侣蛋白β-整合素相互作用，共同介导血细胞的黏附和包封（Zhuang等, 2007）。因此，四跨膜蛋白可以作为"钥匙"介导病毒打开细胞之门，并参与调控病毒侵入细胞的过程。此外，分化簇相关蛋白9（CD9）、CD63、CD81、CD82和CD151是典型的四跨膜蛋白。CD19与CD81胞外结构域之间的动态相互作用对于B细胞共受体转运和B细胞活化的信号转导至关重要（Zhuang等, 2007）。

家蚕杆状核型多角体病毒（BmNPV）是一种特殊的昆虫病毒，属于杆状病毒科（Baculoviridae），α杆状病毒属（Alphabaculovirus），在侵入宿主细胞过程中产生两种形态结构不同的病毒颗粒（Feng等, 2018b）。两种病毒颗粒表型分别为：包涵体衍生病毒（ODV），表现出局限于中肠组织的嗜性；以及出芽病毒（BV），可在组织和细胞间实现系统性传播（Slack和Arif, 2006）。在BV初始进入细胞的过程中，病毒颗粒主要通过吸附性内吞或与宿主细胞表面的特定受体结合来启动感染。作为细胞表面分子，宿主细胞表面的特定受体可以有效靶向病毒并介导内吞作用（Grove和Marsh, 2011）。另一方面，特定受体可以激活特定的信号通路来影响病毒进入细胞，或者诱导病毒构象变化，从而在靶细胞表面或内体腔内诱导膜融合（Kataoka等, 2012）。

杆状病毒BV主要通过内吞作用侵入宿主细胞，而BV囊泡糖蛋白GP64在此过程中发挥关键作用（Kataoka等, 2012）。因此，鉴定昆虫宿主细胞表面GP64的对应受体并阐明该受体分子的特征，对于深入理解BmNPV侵入机制至关重要。迄今为止，已知细胞表面磷脂、质膜中的胆固醇以及某些膜受体蛋白与GP64相互作用，介导病毒颗粒进入家蚕细胞。例如，家蚕E3泛素连接酶SINAL10和膜蛋白BmREEPa均能与GP64相互作用，在介导BmNPV进入细胞中发挥重要作用（Dong等, 2015；Feng等, 2018a）。然而，作为细胞膜受体的四跨膜蛋白在BmNPV感染过程中的详细作用机制仍知之甚少。

细胞凋亡是一种由基因调控的细胞程序性死亡形式，是昆虫中至关重要的先天免疫防御机制。越来越多的证据表明，病毒可以通过抑制凋亡信号通路的激活来调节宿主细胞的凋亡过程，从而重塑细胞内微环境以促进病毒复制和增殖（Lan等, 2026）。例如，在人类中，CD9、TSPAN15和TSPAN31可促进肝细胞癌细胞的增殖或抑制细胞凋亡（Cai等, 2021）。研究表明，CD37调节急性髓系白血病（AML）细胞的存活，并调节急性髓系白血病干细胞的自我更新。CD37表达下调可抑制人急性髓系白血病细胞系THP-1和OCI-AML2的增殖并促进凋亡（Lu等, 2025）。凋亡通路与多种细胞过程形成复杂的信号网络，包括内吞作用和膜融合，这些过程共同决定病毒感宿染者细胞的命运（Wang等, 2021）。先前的研究表明，BmTsp A通过抑制宿主细胞凋亡来介导BmNPV的感染和复制（Mei等, 2023）。然而，这些宿主因子如何通过凋亡调节BmNPV感染的分子机制仍有待阐明。

内吞作用是维持细胞存活和细胞内稳态的必不可少的基本细胞自我保护机制。有效病毒感染的第一步是穿透宿主细胞膜并进入细胞内部，其中网格蛋白介导的内吞作用代表病毒内化的一条关键囊泡运输途径，在介导家蚕宿主BmNPV感染中发挥重要作用（Shi等, 2021）。BmNPV侵入显著触发宿主内吞反应，上调网格蛋白和动力蛋白等关键内吞基因的表达，并促进细胞内分泌体的形成和成熟（Huang等, 2019）。病毒感宿染者引起的内吞激活在整个感染过程中表现得尤为显著，这为病毒复制构建了有利的细胞内微环境，并大幅提高了病毒感染的效率（Cárdenas等, 2024）。现有研究已证实，四跨膜蛋白家族成员广泛参与细胞内吞作用的调节。例如，CD63在宿主细胞的晚期内体和溶酶体中高度富集。质膜定位的CD63主要通过网格蛋白依赖的途径内化，微泡结构也参与CD63介导的内吞作用（Pols和Klumperman, 2009）。此外，Tspan8的敲低可抑制干扰素-γ受体1的脂筏依赖内吞，同时增强其网格蛋白介导的内吞，从而激活Stat1信号通路并重塑细胞免疫反应（Min等, 2023）。作为家蚕BmNPV感染过程中的关键细胞事件，内吞作用的相互作用网络和调控机制值得进一步深入研究。

在我们先前的研究中，我们发现家蚕四跨膜蛋白参与BmNPV感染，并有助于调节凋亡和内吞信号（Mei等, 2023），而比较蛋白质组学研究鉴定出BmTsp E是一种在家蚕BmNPV感染后幼虫中肠显著上调的膜蛋白（Zhang等, 2019）。这些发现提出了一个仍未回答的核心问题：BmTsp E是否作为BmNPV感染所需的宿主因子发挥作用？如果是，则通过哪些膜相关事件实现？为回答这一问题，我们首先对感染过程中以及BmNPV敏感品系和抗性品系之间的BmTsp E表达进行了分析，然后在BmN细胞和幼虫中结合了互补的功能获得和功能缺失方法。我们通过谷胱甘肽-S-转移酶（GST）下拉实验和双分子荧光互补（BiFC）相互作用检测，以及药理学阻断网格蛋白介导的内吞、透射电子显微镜观察和凋亡分析，来考察BmTsp E是否以及如何与病毒包膜糖蛋白GP64相互作用、促进内吞摄取，并调节宿主细胞凋亡从而影响病毒增殖。本研究旨在将BmTsp E定位于GP64介导的进入网络中，并将病毒进入与宿主细胞命运调节联系起来，为蚕业抗病毒保护和在害虫管理中的杆状病毒合理应用提供宿主导向的依据。

# 部分片段

## 实验材料的制备

p50品系的家蚕幼虫饲养于江苏省镇江市江苏科技大学生物技术学院，在受控条件下饲喂新鲜桑叶：26 ± 1 °C，相对湿度75%，12小时光照/12小时黑暗光周期。来源于家蚕卵巢细胞的BmN细胞系使用含有10%胎牛血清（Gibco, Rockville,）的TC-100培养基（瑞德生物科技（北京）有限公司）进行培养。

## BmTsp E的序列特征与生物信息学分析

首先，从家蚕基因组数据库中鉴定和表征了BmTsp E的基本序列。BmTsp E基因的完整开放阅读框包含714 bp，编码237个氨基酸。经判断，BmTsp E具有典型的四跨膜家族特征，包含四个跨膜（TM）结构域（图1A）。除了跨膜结构域外，全长编码蛋白被分为两个胞外环和一个胞内环。两个复杂的……

## 讨论

杆状病毒通过多轮出芽病毒（BV）的进入、复制和释放建立系统性感染。BmNPV主要通过依赖于网格蛋白和动力蛋白的内吞作用进入家蚕细胞（Feng等, 2018b），随后核周围肌动蛋白聚合引导核衣壳通过核孔复合体；新组装的核衣壳随后在质膜上获得病毒融合蛋白，并出芽为子代BV以维持感染循环（Feng等……

## 结论

总之，我们发现BmTsp E在敏感品系和抗性品系家蚕之间表现出高度显著的差异表达特异性。此外，BmTsp E对BmNPV增殖的促进作用表明，它可能作为一种宿主进入因子，与GP64相互作用并介导病毒进入细胞。此外，BmTsp E对病毒增殖的促进作用还通过其参与调节细胞凋亡……得到证实。

## CRediT作者贡献声明

Dan Zhang：初稿撰写、软件、方法学、调查、形式分析、数据管理、概念构思。Xianghan Mei：验证、方法学、调查、形式分析、数据管理。Yan Huang：可视化、验证、软件、调查。Qiaoling Zhao：监督、资源、项目管理、资金获取。Heying Qian：资源、项目管理、资金获取。Dongxu Shen：审阅与编辑、初稿撰写。

## 伦理声明

本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究已获江苏省重点研发计划（现代农业）批准。（批准编号：……）

(BE2021346)。利益冲突声明
作者声明不存在已知的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了江苏省重点研发计划（现代农业）（BE2021346）和现代农业产业技术体系（CARS-17-ZJ0101）的大力支持。我们非常感谢所有成员的热情参与和有益讨论。我们特别感谢孙夏教授慷慨捐赠 pIZT-V5/His-mCherry 载体。
张丹 | 梅向涵 | 黄燕 | 赵巧玲 | 钱海燕 | 沈东旭
中国 212100 江苏镇江 江苏科技大学 生物工程学院 江苏省蚕桑与动物生物技术重点实验室