《Plant Physiology and Biochemistry》：Vanillin aminotransferase-like homologues from
Solanaceae beyond
Capsicum species show differential capacity to support vanillylamine accumulation
in planta
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辣椒素类物质是辣椒属（Capsicum spp.）果实特有的次生代谢物，其生物合成需要香兰素氨基转移酶（vanillin aminotransferase, VAMT）将香兰素转化为香兰胺。尽管VAMT是辣椒素途径的关键酶，但仅通过整体序列相似性很难推断酶的定
辣椒素类物质是辣椒属（Capsicum spp.）果实特有的次生代谢物，其生物合成需要香兰素氨基转移酶（vanillin aminotransferase, VAMT）将香兰素转化为香兰胺。尽管VAMT是辣椒素途径的关键酶，但仅通过整体序列相似性很难推断酶的定量性能。本研究以来自Capsicum chinense（红哈瓦那辣椒）和Capsicum annuum（Yume-matsuri）的VAMT氨基酸序列为查询序列，鉴定番茄和烟草中的同源氨基转移酶，并在瞬时表达本氏烟（Nicotiana benthamiana）叶片中比较它们在喂食香兰素后支持香兰胺积累的能力。结果显示，番茄VAMT类似同源物SlVAMT1和SlVAMT2支持了比辣椒参考酶更高的香兰胺积累，而SlVAMT3未提高积累；烟草同源物NtVAMT1支持了高于辣椒参考酶的积累，而NtVAMT2和本氏烟中的NbVAMT1–NbVAMT3未超过空载体对照。研究表明，序列相似性和已知重组酶活性均无法一致预测体内香兰胺积累，该研究首次在植物水平评估了所测试的烟草VAMT类似同源物。
香兰素氨基转移酶（VAMT）催化辣椒素生物合成中香兰素向香兰胺的转变，是辣椒属（Capsicum spp.）特有的关键酶。尽管VAMT已被证实为辣椒素途径中的核心酶，但近期研究表明，仅凭氨基酸序列相似性难以推断酶的实际催化效率。例如，来自Capsicum annuum cv. Yume-matsuri（CaVAMT）和Capsicum chinense cv. red habanero（CcVAMT）的重组酶仅存在7个氨基酸差异，但体外活性相差约14倍，其中第56位残基影响辅因子吡哆醛-5′-磷酸（PLP）的亲和力。番茄等茄科植物基因组中保留有VAMT类似同源物，但这些同源物在植物体内是否具有支持香兰胺积累的能力尚不清楚。该问题对理解VAMT/GABA-T家族的进化分化和植物代谢工程中氨基转移酶的选择具有重要意义。为此，研究人员以两种辣椒VAMT序列为查询序列，在番茄和烟草中鉴定同源氨基转移酶，并在本氏烟（Nicotiana benthamiana）瞬时表达体系中比较它们在喂食香兰素后支持香兰胺积累的能力。结果显示，番茄同源物SlVAMT1和SlVAMT2支持了比辣椒参考酶更高的香兰胺积累，而SlVAMT3未能超过空载体对照；烟草同源物NtVAMT1支持了高于辣椒参考酶的积累，但NtVAMT2和本氏烟同源物未检测到增强效应。这些结果表明，体内香兰胺积累能力在茄科植物中分布更广，且无法仅由序列相似性或重组酶活性预测，强调了直接进行体内评估的重要性。
关键技术方法：研究中使用Sol Genomics Network提供的番茄（ITAG4.0/SL4.0）和烟草参考基因组预测蛋白序列；采用Golden Gate克隆组装由35S启动子驱动、含p19沉默抑制子的表达构建体，转化农杆菌EHA105后浸润5周龄本氏烟叶片。每个构建体设4个生物学重复，空载体为对照。叶片在3 dpi喂食2.6 mM香兰素，6 dpi收获；冻干后用100%甲醇提取，采用UPLC-MS/MS多反应监测（MRM）定量香兰胺、香兰素和香草醇，并进行方法验证，包括线性、LOD/LOQ及回收率校正；数据用双因素方差分析和Tukey多重比较检验。
研究结果如下：
13.1 分析方法开发与验证：通过系统评价目标分析物在纯溶剂和叶片基质中的检测限（LOD）和定量限（LOQ），并比较五种提取溶剂的回收率，确定甲醇为最佳提取溶剂，证明该方法满足植物基质中低丰度代谢物定量要求。
13.2 瞬时表达试验与香兰素喂食优化：通过比较0 dpi和3 dpi两种喂食方式，发现3 dpi喂食可显著提高香兰胺积累，并确定该条件用于后续筛选。同时，CaVAMT支持的积累高于CcVAMT，与先前体外研究一致；空载体对照中也检测到基础香兰胺背景积累，提示烟草内源代谢可产生该物质。
13.3 番茄VAMT类似同源物在植物体内差异支持香兰胺积累：在喂食香兰素后，SlVAMT1和SlVAMT2表达叶片中香兰胺含量分别达134.3和185.9 ng mg
-1 DW，高于CaVAMT（47.4 ng mg
-1 DW），而SlVAMT3未增加积累。该结果表明，番茄中多个VAMT类似同源物在植物体内具有增强香兰胺积累的能力，但其功能存在明显分化。
13.4 烟草VAMT类似同源物支持的差异香兰胺积累：在烟草同源物中，NtVAMT1支持的积累高于辣椒参考酶但低于番茄SlVAMT1/2；NtVAMT2及所有NbVAMT未超过空载体。这是首次在植物水平评估这些烟草同源物，显示其功能也存在差异。
13.5 VAMT类似同源物的生物信息学分析：对候选蛋白进行序列比对后，所有番茄同源物和NtVAMT1均保留催化赖氨酸（K284），但SlVAMT3仍无积累；部分烟草基因模型缺失催化赖氨酸区域，可能与基因模型不完整或注释限制有关。N端延伸和亚细胞定位预测均不能解释积累差异，说明保守的催化核心并非体内功能的充分条件。
讨论与结论部分：原文讨论指出，重组体外测定反映内在催化性质，而瞬时表达后的代谢物积累是蛋白丰度、定位、前体供应、宿主代谢和代谢转化等因素整合的结果。本研究中，番茄同源物在体内表现优于辣椒VAMT，可能是由于异源宿主细胞环境与原体系间的兼容性差异。空载体对照的香兰胺背景可能与农杆菌浸润诱导的防御相关代谢重编程有关，但其具体来源未明确。NtVAMT1的阳性结果提供了首个植物水平证据，但转录和蛋白积累未定量，因此不能将构建体间的差异简单归因于催化活性。序列特征如催化赖氨酸和N端定位信号亦无法预测体内表现。虽然番茄和烟草可产生或释放香兰素，但缺乏辣椒素类物质，表明它们缺少将香兰素导向香兰胺并进入辣椒素合成所需的专门酶及调控框架。
研究结论翻译如下：该研究结果表明，先前在重组测定中显示具有香兰胺形成活性的番茄VAMT类似同源物，在瞬时植物环境中能够支持意料之外的高水平香兰胺积累。此外，该研究首次在植物水平评估了所测试的烟草VAMT类似同源物。序列相似性和先前报道的重组酶活性均无法一致预测体内观察到的香兰胺积累。由于转录本和蛋白质积累未被定量，这些差异不能仅归因于内在催化特性。总之，这些发现揭示了茄科VAMT类似同源物支持香兰胺积累能力的显著差异，并强调了在评估候选途径酶时进行直接体内评估的价值。
