番茄果实快速碱化因子（RALF）肽的基础表征揭示SlRALF家族的结构与功能特化

《Plant Science》：Foundational characterization of tomato fruit RALF peptides reveals structural and functional specialization within the SlRALF family

　　

SlRALF5、SlRALF7和SlRALF10是番茄果实中主要表达的快速碱化因子（RALF）肽。SlRALF5和SlRALF7保留典型RALF基序和生物活性，而SlRALF10在结构上具有分化。SlRALF5和SlRALF7抑制根生长并诱导细胞外碱化（extracellular alkalinization），但SlRALF10不表现出这些活性。SlRALF5、SlRALF7和SlRALF10与果实表达蛋白SlLRX2和SlLRX5发生物理互作。结构建模预测SlLRX5–SlRALF10复合物具有不同的静电性质，提示其在果实发育和成熟过程中具有功能特化。

研究背景：快速碱化因子（RALF）肽是富含半胱氨酸的植物肽激素，参与根生长、生殖、免疫和非生物胁迫适应。RALF前体一般为50–250个氨基酸，含N端信号肽，经位点-1蛋白酶（S1P）在RRXL基序处蛋白酶解成熟。RALF已在50多种植物中鉴定。RALF最初作为质膜Catharanthus roseus受体样激酶1样（CrRLK1L）蛋白和LORELEI/LORELEI样糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白（LRE/LLG）家族配体；拟南芥FERONIA（FER）研究最充分。近年研究表明RALF还具细胞壁完整性维持的结构与信号双重作用，可与富亮氨酸重复-伸展蛋白（LRX）互作；其C端在酸性条件下高亲和结合亮氨酸富集重复（LRR）结构域，暴露阳离子残基并与去甲酯化、带负电果胶形成超分子组装。现有问题在于RALF在园艺作物果实发育和成熟中的作用了解较少；草莓FaRALF29及FER同源基因研究提供线索，番茄SlCrRLK1L20正调控果实成熟，但LRX在果实中的角色未知。为此，研究人员鉴定番茄果实优先表达的SlRALF5、SlRALF7、SlRALF10及SlLRX2、SlLRX5，并结合生理生化分析开展研究。研究结论表明，SlRALF5和SlRALF7保留典型RALF特征和活性，SlRALF10结构分化且缺乏根生长抑制和碱化活性；三者均与SlLRX2和SlLRX5互作；结构模型预测SlLRX5–SlRALF10界面静电性质不同。其意义在于为RALF–LRX模块调控番茄果实细胞壁特性提供初步框架。

技术方法：利用SGN番茄功能基因组数据库（SGN-TFGD）RNA-seq数据和定量实时PCR（qRT-PCR）分析表达；进行系统发育及多序列比对；用合成SlRALF肽处理拟南芥（A. thaliana，Col-0）和番茄（S. lycopersicum，Money Maker）进行根生长和幼苗生物量测定；用番茄（S. peruvianum）野生型悬浮细胞实时pH监测细胞外碱化；用拟南芥叶盘和番茄果皮进行活性氧（ROS）发光测定；在N. benthamiana瞬时表达后进行共免疫沉淀（Co-IP）和免疫印迹；用AlphaFold2/3建模并用自适应Poisson-Boltzmann求解器（APBS）计算静电表面。样本来源包括SGN-TFGD RNA-seq数据及上述植物材料。

研究结果：
2.1 SlRALF与SlLRX基因表达模式分析：通过SGN RNA-seq数据和qRT-PCR分析11个SlRALF及5个SlLRX在根、叶、芽、花、1–3 cm果、成熟绿果、破色果和破色后10天果中的表达。SlRALF5和SlRALF7主要在成熟绿和红熟阶段表达；SlRALF9和SlRALF10表达至成熟绿后下降；其余SlRALF多为其他器官特异。SlLRX5在果实中表达最高并于成熟末达峰，SlLRX2较低；SlLRX1和SlLRX3主要在花中。系统发育显示SlRALF5/7与拟南芥RALF1/22/23/33同组，SlRALF9/10与RALF27同组；SlLRX5与LRX5/6近，SlLRX2与LRX1/2近。作者据此提出SlRALF5/7可能参与成熟，SlRALF9/10可能作用于细胞扩展至成熟绿阶段。
2.2 番茄果实表达的SlRALF5、SlRALF7和SlRALF10成熟蛋白保守基序：通过成熟肽序列比对，SlRALF2、SlRALF5和SlRALF7属真RALF，含RRXL、YISY、GASYY、PYXRGCS和RCRR(S)等基序并保留Leu-11；SlRALF9缺YISY/YLSY，SlRALF10具YLSY但缺周围碱性Arg且含6个酸性氨基酸。LRX结合相关两个Cys环及Tyr残基在SlRALF2/5/7中保守，在SlRALF9/10中缺失或改变，SlRALF10仅保留一个Tyr。结论为SlRALF10结构明显分化，其胞外伙伴互作机制可能不同。
2.3 SlRALF5/7/10在拟南芥中的生理响应：合成肽处理5日龄拟南芥幼苗2天后，SlRALF5和SlRALF7显著抑制主根生长，SlRALF10不抑制；SlRALF5抑制幼苗鲜重，SlRALF10无影响；番茄中SlRALF5抑制根生长，SlRALF10无 detectable 效应。实时pH监测显示SlRALF5和SlRALF7诱导番茄悬浮细胞细胞外碱化，SlRALF10不诱导。ROS测定中，测试肽在拟南芥叶盘及番茄成熟绿和红熟果皮均未引起显著ROS响应。结论为根生长抑制与细胞外碱化是SlRALF5/7的偶联活性，SlRALF10缺乏这些活性。
2.4 SlRALF5/7/10与SlLRX蛋白互作：通过N. benthamiana共表达SlLRX2-GFP或SlLRX5-GFP与SlRALF-HA，并用GFP-Trap进行Co-IP，检测到SlRALF5、SlRALF7和SlRALF10成熟肽与SlLRX2和SlLRX5共沉淀。LRX的LRR结构域中形成二硫键的Cys及RALF结合口袋相关残基高度保守。结论为三者与SlLRX2和SlLRX5发生物理互作，结合构象可能类似拟南芥LRX–RALF。
2.5 SlRALF5/10成熟肽与SlLRX5互作预测：用AlphaFold建模SlLRX5–SlRALF5和SlLRX5–SlRALF10复合物，预测SlRALF肽呈二硫键稳定的折叠构象并嵌入LRR结合口袋。SlLRX5–SlRALF5模型与拟南芥LRX–RALF构型相容，SlRALF5的K78、R85和K94保持溶剂暴露；SlLRX5–SlRALF10复合物构象不同，K62、K69和K78邻近负电残基，预测改变其方向和静电表面。结论为SlLRX5–SlRALF10界面静电性质不同，提示功能特化，尚需实验验证。

讨论总结：讨论指出RALF在根发育、生殖、胁迫和免疫中研究较多，而果实发育和成熟中的作用了解不足；本研究提供将SlRALF肽与番茄果实生物学联系的初步框架。表达分析显示SlRALF5和SlRALF7贯穿成熟表达，SlRALF10在早期果实中转录丰度最高，支持家族内功能分化。结构分析显示SlRALF10具酸性等电点（pI）、LLG/LRX/果胶互作相关基序部分缺失或改变，SlRALF5/7则较保守；生理结果与结构差异一致。建模提示SlRALF5和SlRALF10与SlLRX5形成不同静电界面，讨论认为这可能与果实发育中果胶甲酯化变化相关，但尚待确定。SlCrRLK1L20随成熟增加且与SlRALF5、SlRALF7和SlLRX5表达并行，已有酵母双杂报道SlRALF5/7与SlCrRLK1L20胞外域互作，提示SlRALF5–SlLRX5–SlCrRLK1L20模块可能参与成熟，但其与果胶重塑和细胞壁完整性的分子机制仍待建立。
研究结论翻译：总体而言，本研究发现与番茄果实发育和成熟不同阶段相关的SlRALF肽具有不同的结构和功能特性。具体而言，SlRALF5和SlRALF7与成熟相关，而SlRALF10表现出不同特性并主要在果实早期发育中表达。结合其与SlLRX蛋白的互作，这些结果支持RALF–LRX模块在果实发育过程中调控细胞壁特性的作用。仍需进一步体内研究确定SlRALF、SlLRX、SlCrRLK1L和果胶互作如何贡献于果实成熟过程中的细胞壁重塑。