健康鸡群来源自然弱毒传染性喉气管炎病毒（ILTV）CH/HN/2022的基因组特征及疫苗候选潜力

《Poultry Science》：Genomic characterization and vaccine potential of a naturally attenuated infectious laryngotracheitis virus from healthy chickens

　　

摘要：传染性喉气管炎（infectious laryngotracheitis, ILT）是由传染性喉气管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus, ILTV）引起的一种鸡急性、高度接触性呼吸道疾病，持续给全球家禽业造成显著经济损失。当前减毒活疫苗虽有效，但存在残余毒力、毒力返强和建立潜伏感染的风险，因此亟需开发更安全、更有效的疫苗候选株。本研究在中国河南省常规诊断监测中，从临床健康蛋鸡分离到一株ILTV，命名为CH/HN/2022。该鸡群无ILT疫苗接种史，采样时无ILT临床症状。对CH/HN/2022完整基因组进行测序，其大小为152,218 bp，G+C含量48%，预测有79个开放阅读框（open reading frame, ORF）。系统发育分析显示，CH/HN/2022与美国（US）强毒株81658和USDA及组织培养源（tissue culture origin, TCO）疫苗株LT-IVAX聚于Clade II，与81658株核苷酸同一性为98.8%，但与15株既往报道的中国分离株同一性仅为95.8–96.5%。值得注意的是，与中国强毒株相比，CH/HN/2022在独特长区（unique long, UL）存在～3,340 bp缺失，并在末端重复区（terminal repeat, TR）和内部重复区（internal repeat, IR）存在855 bp插入。与强毒株WG的比较分析发现，糖蛋白D（glycoprotein D, gD）、糖蛋白J（glycoprotein J, gJ）和ORF C蛋白存在显著氨基酸差异。CH/HN/2022可在LMH（Leghorn male hepatocellular, LMH）细胞中高效复制。4周龄无特定病原（specific pathogen-free, SPF）鸡致病性评估表明，经气管内途径接种的鸡无死亡，仅10%出现轻微、短暂呼吸道症状，试验条件下未检测到向接触鸡传播。单剂滴眼接种CH/HN/2022对强毒WG株致死性攻毒提供完全保护。这些发现表明，CH/HN/2022是一株具有独特基因组特征、弱毒表型及在试验条件下具有良好保护效力的自然弱毒ILTV，是减毒活疫苗开发的有前景候选株。

传染性喉气管炎（ILT）是由传染性喉气管炎病毒（ILTV；Gallid herpesvirus type 1, GaHV-1）引起的鸡急性、高度接触性上呼吸道疾病，死亡率可达5%–70%，给全球家禽业造成经济损失。现有鸡胚源（chicken embryo origin, CEO）和组织培养源（tissue culture origin, TCO）减毒活疫苗虽广泛应用，但存在残余毒力、潜伏感染与应激再激活、鸡传鸡过程中毒力返强及疫苗株重组产生强毒重组体的风险；表达ILTV保护性抗原的重组病毒载体疫苗安全性较好，但保护力可能不及减毒活疫苗。中国自2017年以来ILT流行增加，且从临床健康鸡群发现自然弱毒株可能为更安全疫苗开发提供资源。Minghe Xu等从河南一未接种ILT疫苗、临床健康的蛋鸡群中分离ILTV CH/HN/2022，并开展基因组、系统发育、体外生长、致病性、免疫原性和攻毒保护研究。研究背景提示，自然弱毒株已在鸡群中持续存在而不致病，其弱毒机制可能更稳定，但仍需全面表征。

关键技术方法（不超过250字）：样本队列来源为河南驻马店某蛋鸡场60,000只210日龄Hy-Line Brown蛋鸡，无ILT疫苗接种史，采集常规口咽拭子。研究人员以聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）筛查常见禽病原；将ILTV阳性样本接种9日龄SPF鸡胚绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane, CAM）传6代后接LMH细胞分离，透射电镜鉴定；用Illumina和PacBio测全基因组，MAFFT、MegAlign和MEGA 7进行比对、同一性计算及最大似然系统发育分析；比较基因组并用原始临床样本PCR验证gD、gJ和ORF C突变；用AlphaFold 3预测蛋白结构；建立实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, RT-qPCR）定量病毒载量和排毒；在LMH细胞做生长动力学；在4周龄SPF鸡评估致病性、排毒、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）抗体和WG攻毒保护。

结果部分：
Virus Isolation and Identification（病毒分离与鉴定）：口咽拭子PCR仅检出ILTV；鸡胚CAM传6代无死亡和CAM病变但PCR阳性；LMH细胞72 hpi出现细胞圆缩、聚集和合胞体，电镜见100–150 nm疱疹病毒样颗粒。结论为成功分离CH/HN/2022。
Complete Genome Sequence and Phylogenetic Analysis（全基因组序列与系统发育分析）：全基因组152,218 bp，G+C含量48%，UL区109,599 bp、US区13,094 bp、IR/TR各14,762 bp，预测79个ORF；CH/HN/2022属Clade II，与81658、USDA和LT-IVAX同一性分别为98.8%、98.6%和97.7%，与中国分离株为95.8%–96.5%；与中国强毒株比有UL区～3,340 bp缺失及TR/IR区855 bp插入；与WG比gD有57个氨基酸N端延伸和6个残基差异，gJ有12个残基差异并缺654–663位10个氨基酸，ORF C有单个天冬氨酸缺失、2个额外差异及C端截短（303 vs 335个氨基酸）。结论为CH/HN/2022具有独特基因组特征和进化关系。
Verification of Mutations in the Original Clinical Sample（原始临床样本突变验证）：从原始口咽拭子DNA扩增gD、gJ和ORF C区域并测序，确认这些突变在原始样本中已存在，并非CAM或LMH传代获得；测序扩增子内未见差异，但不能排除基因组其他区域变化。
Predicted structural differences in gD, gJ, and ORF C（gD、gJ和ORF C预测结构差异）：AlphaFold 3比较显示，gD高置信核心高度保守（206个对应残基RMSD 0.37 ?，近似TM-score 0.995），主要差异为57个氨基酸N端延伸；gJ约54%序列预测无序，高置信核心保守（142个残基RMSD 1.13 ?，近似TM-score 0.94），多数替换和10个氨基酸缺失位于低置信区；ORF C结构差异最明显，WG残基304–335在CH/HN/2022缺失，其中310–327为α螺旋。结论为gD和gJ核心大体保守，ORF C丢失C端结构元件。
In Vitro Growth Characteristics（体外生长特性）：MOI 0.01感染LMH细胞后，12 hpi滴度开始上升，108 hpi达峰值10^4.93 TCID₅₀/100 μL，120 hpi略降。结论为CH/HN/2022可在LMH细胞有效复制。
Pathogenicity of CH/HN/2022 in SPF Chickens（SPF鸡致病性）：4周龄SPF鸡以10^6.1 TCID₅₀滴眼或气管内接种并观察21天；滴眼组无临床异常，气管内组1/10（10%）在72 hpi出现轻微喘息并于48 h内恢复，无死亡；接触组和对照正常；21 dpi喉和气管病毒载量与对照无显著差异，无大体病变，仅轻度黏膜增厚和少量炎细胞浸润；4 dpi所有感染鸡排毒，8 dpi滴眼组2/10阳性、气管组阴性，12 dpi均阴性，接触鸡无排毒。结论为CH/HN/2022呈弱毒表型且水平传播能力低。
Immunogenicity and Protective Efficacy of CH/HN/2022 in SPF Chickens（SPF鸡免疫原性与保护效力）：单剂10^6.1 TCID₅₀滴眼后1周可检出gD抗体并升至3周；3周后以2×10^4.3 EID₅₀ WG气管内攻毒；模拟接种攻毒组48 h出现症状、72 h血性黏液，6 dpc全部死亡并有严重气管病变；疫苗攻毒组14天无临床异常、无死亡、无大体病变，仅轻度组织变化；4 dpc 3/10疫苗鸡检出低水平WG排毒，8和12 dpc未检出；14 dpc喉和气管病毒载量显著低于模拟组（P < 0.01），与空白对照无显著差异。结论为单剂CH/HN/2022提供完全保护并显著减少病毒载量和排毒。

讨论部分总结：作者认为，从无ILT疫苗接种史的健康鸡群分离CH/HN/2022，提示该株可在鸡群中循环而不引起明显疾病；其与TCO疫苗株LT-IVAX仅97.7%同一性，并具有独特UL区缺失、TR/IR插入及gD、gJ、ORF C氨基酸变化，作者判断其最可能为自然弱毒田间株而非疫苗株返分离。UL区大缺失、TR/IR插入及gD、gJ、ORF C变化可能参与弱毒表型，但需反向遗传学验证；LMH细胞高效复制有利于疫苗生产和遗传改造；SPF鸡试验显示安全性好、接触传播低；单剂免疫可完全抵抗致死性WG攻毒，但因无头对头比较，不能直接与商业CEO/TCO疫苗或实验性基因缺失疫苗排序。局限性包括：未用反向遗传学确认单个突变对弱毒的贡献；保护性免疫持续期仅观察至3周；田间商业鸡群效果未评估；潜伏感染需三叉神经节分析和再激活研究；抗体等免疫相关指标未全面评估；WG在所用LMH培养条件下不能有效增殖，无法直接比较生长动力学。

研究结论翻译：总之，本研究报道了从中国临床健康鸡中分离并全面表征的一株自然弱毒ILTV CH/HN/2022。该株具有独特基因组特征，可在LMH细胞中高效复制，在SPF鸡中显示良好安全性，并对强毒ILTV株致死性攻毒提供完全保护。这些发现表明CH/HN/2022是有前景的疫苗候选株，并有助于理解ILTV遗传多样性和弱毒机制。未来研究应聚焦评估CH/HN/2022在田间条件下的效力和安全性，基于其独特基因组特征开发区分感染与免疫动物（differentiating infected from vaccinated animals, DIVA）策略，并探索其作为病毒载体用于联合疫苗开发的潜力。