靶向ERO1α重塑三阴性乳腺癌糖蛋白组并增强PD-1阻断介导的肿瘤免疫监视

《Redox Biology》：Targeting ERO1α Triggers Tumor Immunosurveillance in Triple-Negative Breast Cancer

　　

• ERO1α依赖性糖蛋白组重塑调控三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）的肿瘤免疫原性及免疫信号。
• ERO1α缺失重塑肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME），增强抗原提呈及对PD-1阻断的反应性。
• 以小分子抑制剂靶向ERO1α使TNBC肿瘤对免疫检查点治疗敏感。
TNBC占所有乳腺癌的15–20%，与高转移潜能、早期复发和总生存差相关。TNBC定义为雌激素受体（estrogen receptor, ER）、孕激素受体（progesterone receptor, PR）和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）表达缺失。该分子特征限制了靶向治疗选择，使化疗及新近的免疫治疗成为主要治疗策略。尽管靶向程序性死亡受体1/程序性死亡配体1（PD-1/PD-L1）轴的免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors）在部分患者中显示临床获益，但大多数TNBC肿瘤免疫原性差且对免疫治疗反应有限。因此，理解免疫逃逸机制并识别将免疫难治（“冷”）TNBC转化为免疫活跃（“热”）肿瘤的策略仍是主要未满足临床需求。
内质网（endoplasmic reticulum, ER）在蛋白折叠、氧化还原稳态和细胞应激适应中起核心作用。ER稳态扰动诱导ER应激并激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR），这是一种适应性信号网络，使肿瘤细胞在缺氧、癌基因激活和营养缺乏等恶劣条件下存活。除支持肿瘤适应外，越来越多证据表明UPR通过促进免疫抑制主动调控肿瘤–免疫相互作用。UPR介质内质网氧化还原酶1α（endoplasmic reticulum oxidoreductin 1 alpha, ERO1α；ERO1A；下文称ERO1）是氧化蛋白折叠的关键调节因子，与其伙伴蛋白二硫键异构酶1（protein disulphide isomerase 1, PDI）一起催化分泌蛋白和膜蛋白中的二硫键形成，同时参与代谢适应。ERO1表达在多种癌症中升高，并与不良预后、转移进展和免疫逃逸相关。然而，ERO1与肿瘤免疫调控之间的联系机制仍不完全清楚，且尚未在TNBC中表征。
在TNBC中，研究人员及其他团队此前证明ERO1参与促肿瘤因子的氧化折叠，包括血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF），从而促进血管生成、肿瘤转移和对缺氧应激的适应。除促血管生成活性外，VEGF通过限制TME内T细胞募集和浸润参与免疫逃逸，提示ERO1也可能在肿瘤免疫调控中发挥作用。
与既往发现一致，ERO1缺失降低ER的氧化势，从而增强MAGT1依赖的VEGF和潜在其他客户蛋白的N-糖基化。由于糖基化不仅关键调控肿瘤相关蛋白的稳定性、分泌，还调控抗原性和免疫识别，这些发现提示ERO1缺失可能重塑肿瘤糖蛋白组并由此影响肿瘤免疫。
基于此基础，研究人员探究ERO1依赖性糖蛋白组重塑是否影响TNBC抗肿瘤免疫及对PD-1阻断的反应性。通过对TME进行整合的无偏糖蛋白组、转录组和免疫分析，研究人员证明ERO1缺失重塑TNBC糖蛋白组，增强TME内髓系细胞浸润和抗原提呈程序，从而使这些原本难治的肿瘤对PD-1阻断敏感。此外，ERO1的药理学抑制在肿瘤中重现遗传性ERO1缺失的效应并增强抗肿瘤免疫。总之，研究人员的发现确定ERO1是TNBC肿瘤–免疫相互作用的调节因子，与糖蛋白组重塑和抗原提呈程序相关，并支持ERO1作为联合免疫治疗的治疗靶点。

该研究围绕TNBC免疫治疗反应有限这一核心问题展开。TNBC约占全部乳腺癌的15–20%，缺乏ER、PR和HER2表达，靶向治疗选择有限；尽管PD-1/PD-L1阻断在部分患者中有效，但多数TNBC免疫原性低、对免疫治疗反应不足，如何将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤是未满足的临床需求。ERO1α（endoplasmic reticulum oxidoreductin 1 alpha，ERO1；ERO1A）是UPR相关ER氧化还原酶，参与氧化蛋白折叠、缺氧适应和肿瘤进展，在多种肿瘤中高表达并与不良预后、转移和免疫逃逸相关；但其在TNBC肿瘤–免疫调控中的作用尚不清楚。既往研究提示ERO1缺失可降低ER氧化势、增强MAGT1依赖的VEGF N-糖基化，提示糖蛋白组重塑可能影响免疫识别。该研究发表于《Redox Biology》，旨在探究ERO1依赖性糖蛋白组重塑是否影响TNBC抗肿瘤免疫及PD-1阻断反应性；研究结论支持ERO1作为联合免疫治疗的可操作靶点。

关键技术方法：分析PRIDE PXD024322中300例乳腺癌FFPE蛋白组数据；采用2005–2008年意大利Cremona来源的组织芯片（tissue microarray, TMA；52例TNBC、48例Luminal A）行PD-1/PD-L1免疫荧光。用CRISPR/Cas9构建ERO1敲除（knockout, KO）E0771和MDA-MB-231细胞，缺氧培养，刀豆蛋白A（concanavalin A, ConA）/小麦胚芽凝集素（wheat germ agglutinin, WGA）富集结合液相色谱–串联质谱（LC-MS/MS）分析糖蛋白组，roGFP2检测ER氧化还原。建立CD45.1受体接受CD45.2野生型（wild-type, WT）或ERO1 KO骨髓的嵌合小鼠，原位植入E0771，给予抗PD-1和ERO1抑制剂I29；采用流式细胞术、磁共振成像（MRI）、bulk RNA测序（RNA-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq）。

研究结果：
1. ERO1蛋白表达在TNBC中上调，且与免疫检查点表达关联有限：通过PXD024322蛋白组和TMA免疫荧光分析发现，ERO1蛋白在TNBC及侵袭性亚型中高于正常乳腺组织；ERO1与PD-1、CTLA-4无显著相关，与PD-L1仅弱正相关；TMA中PD-1/PD-L1在Luminal A与TNBC间无显著差异。结论提示ERO1在TNBC富集，但可能通过其他机制调控肿瘤–免疫相互作用。
2. ERO1 KO E0771 TNBC细胞分泌糖蛋白组中免疫系统通路富集：通过CRISPR/Cas9构建ERO1 KO细胞，MTS和迁移实验显示其生长与迁移未受显著影响，但条件培养基促人脐静脉内皮细胞（HUVEC）迁移能力降低；缺氧下ConA/WGA富集联合LC-MS/MS显示，ERO1 KO分泌糖蛋白组富集“细胞外基质组织”和“先天免疫系统”通路；缺氧ERO1 KO细胞中PD-L1丰度和糖基化增加，roGFP2显示ER更还原，β-巯基乙醇及MDA-MB-231验证支持该现象。
3. 肿瘤细胞内在ERO1促进免疫健全骨髓嵌合小鼠对PD-1阻断的反应：通过CD45.2 WT或ERO1 KO骨髓移植至CD45.1受体并原位植入WT或ERO1 KO E0771，抗PD-1治疗显示基础条件下肿瘤生长无显著差异；ERO1 KO肿瘤对PD-1阻断反应显著增强，部分完全消退，且WT或ERO1 KO骨髓背景均可见。结论表明该增敏主要由肿瘤细胞ERO1缺失驱动。
4. ERO1缺失促进髓系转录重塑：通过bulk RNA-seq和GSEA发现ERO1 KO肿瘤中PD-1信号通路受显著调节，巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞及抗原加工提呈相关基因集富集；M7免疫签名网络显示先天免疫、抗原提呈、髓系募集、炎症及免疫检查点阻断相关程序协同富集；scRNA-seq显示免疫组成总体差异不显著，但ERO1 KO肿瘤巨噬细胞频率增加、单核细胞减少，且独立于骨髓基因型。
5. ERO1缺陷肿瘤显示髓系浸润和PD-1表达增加：通过流式细胞术发现淋巴区室无主要差异，ERO1 KO肿瘤中树突状细胞和中性粒细胞显著增加，树突状细胞增加独立于骨髓基因型；免疫荧光显示ERO1 KO肿瘤PD-1信号增加而PD-L1未变。结论支持ERO1缺失重塑髓系区室并提高PD-1表达。
6. 药理学ERO1抑制重现ERO1缺陷肿瘤表型：在WT骨髓嵌合小鼠的WT E0771原位模型中，I29联合抗PD-1较I29单药降低肿瘤生长，其生长曲线接近ERO1 KO肿瘤接受抗PD-1治疗；MRI显示联合治疗肿瘤体积显著降低；流式显示I29处理肿瘤淋巴区室无主要差异，但树突状细胞和中性粒细胞增加，重现遗传缺失的髓系改变。
7. ERO1缺失在免疫健全小鼠赋予持久PD-1阻断敏感性：在C57BL/6J小鼠原位WT或ERO1 KO E0771模型中，抗PD-1治疗使ERO1 KO肿瘤生长受抑并逐渐消退，25天时多数几乎完全抑制，完全消退者随访20天无复发；流式显示ERO1 KO肿瘤中PD-1⁺CD8⁺ T细胞、颗粒酶B（GrzB）⁺CD8⁺ T细胞及NK细胞增加，中性粒细胞增加且PD-L1表达更高。结论表明肿瘤细胞内在ERO1决定免疫检查点抑制反应。

讨论部分指出，该研究确定ERO1是TNBC肿瘤免疫原性和免疫检查点反应性的关键调节因子；ERO1不仅参与氧化蛋白折叠、ER应激适应和肿瘤进展，还通过肿瘤细胞内在机制连接ER氧化还原与蛋白糖基化，促进更免疫活跃的TME。UPR的IRE1、PERK和ATF6分支支持肿瘤适应并通过肿瘤细胞内在及TME依赖机制塑造抗肿瘤免疫；既往在结肠癌、肺腺癌和黑色素瘤中显示ERO1缺失增强抗PD-1疗效，本研究在TNBC中提供肿瘤内在ERO1与免疫检查点反应性的机制证据。TNBC具有组成性ER应激和持续UPR激活，免疫检查点阻断仅对部分患者有效；基于ERO1缺失经MAGT1增强VEGF N-糖基化的既往发现，本研究糖蛋白组分析显示ERO1缺失的分泌蛋白富集免疫相关通路，RNA-seq中MAGT1上调并与“PD-1共抑制”通路相关，支持ERO1缺失诱导的氧化还原重塑可能通过MAGT1影响肿瘤免疫糖蛋白组。骨髓移植实验显示肿瘤细胞ERO1缺失而非造血区室ERO1缺失决定PD-1阻断增敏；ERO1 KO肿瘤髓系浸润增加及抗原加工提呈通路富集，伴随免疫检查点阻断反应签名富集，支持从相对免疫难治状态向更免疫活跃、检查点反应性TNBC微环境转化。I29药理抑制重现遗传缺失效应，增强抗PD-1疗效并降低免疫健全宿主肿瘤负荷，提供ERO1作为TNBC治疗靶点的概念验证。

研究结论部分翻译如下：总体而言，该研究确定ERO1是TNBC肿瘤免疫原性和免疫检查点反应性的关键调节因子。通过将ER氧化还原和糖蛋白组重塑与肿瘤–免疫相互作用调控联系起来，研究人员的发现拓展了对UPR通过ERO1促进免疫逃逸机制的理解。研究人员证明，ERO1的遗传缺失或药理学抑制增强抗肿瘤免疫并使TNBC肿瘤对抗PD-1（anti–PD-1）治疗敏感。这些效应与ER氧化还原改变、肿瘤糖基化、抗原提呈增强以及肿瘤髓系区室向更免疫活跃状态重塑相关。总之，这些发现建立了ERO1介导的肿瘤糖蛋白组重塑与TME内免疫监视之间的机制联系，并支持ERO1作为提高TNBC免疫检查点阻断疗效的有前景的治疗靶点。