猪卵母细胞体外成熟作为生殖毒理学研究的一种潜在替代测试模型

《Reproductive Toxicology》：In vitro maturation of porcine oocytes as a potential alternative testing model for reproductive toxicology studies

　　## 摘要已有大量化学物质被报道对人体和动物健康有害，尤其是对女性生殖系统的影响。化学物质暴露可通过干扰下丘脑-垂体-性腺轴并影响内分泌系统、卵巢、卵泡液和生殖细胞，从而引发生殖障碍。此外，化学物质暴露还可通过直接影响卵母细胞成熟来损害女性生殖功能，而卵母细胞成熟是在排卵前于卵泡液内完成的。因此，评估这些化学物质对卵母细胞成熟的毒性效应变得越来越重要。卵母细胞体外成熟（IVM）是阐明卵母细胞成熟机制的重要平台。特别是，猪卵母细胞的IVM可能是研究人类卵母细胞成熟的更合适的模型，因为猪在生理和遗传方面与其他常用动物模型相比与人类具有更高的相似性。此外，由于猪卵母细胞IVM使用的是从屠宰场副产物卵巢中获取的未成熟卵母细胞，该系统避免了实验动物的使用，具有伦理和实际操作上的优势。尽管越来越多的生殖毒理学研究采用猪卵母细胞IVM，但关于猪卵母细胞质量评估指标的综合性总结仍然有限。因此，本综述旨在总结评估猪卵母细胞质量的方法及其基本原理和应用，从而提供一个整合性概述，以推进猪IVM作为生殖毒性评估模型的使用。## 引言随着工业化和农业技术的进步，人类和动物被无意暴露于各种化合物中，如环境污染物、金属、天然毒素和合成物质[1, 2, 3]。由于某些具有生物蓄积潜力的化学物质存在于空气、土壤、食品和水体中，它们很容易进入生物体并随时间不断积累[2, 3, 4]。这种蓄积通过引起肝毒性、肾毒性和神经毒性，以及损害生长、产奶量和生育力来威胁人类和动物健康[1, 4-9]。特别是，人们越来越关注其对女性生殖的影响[10-13]。与化学物质暴露相关的女性生殖障碍包括内分泌干扰、卵巢功能障碍和卵母细胞成熟紊乱[14-16]。化学化合物可通过模拟激素作用、调节内源性激素的合成与代谢，以及改变激素受体表达和下游信号传导来损害女性生殖功能[17-19]。这些化学物质可干扰下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴，进而通过抑制卵泡生长和加速卵泡凋亡来影响卵巢功能[19, 20]。最终，卵巢功能障碍导致卵母细胞成熟受损，其特征包括减数分裂细胞周期阻滞、微管纤维形成缺陷、母源性mRNA和蛋白质缺乏以及卵泡膜细胞扩张紊乱[18, 21, 22]。此外，当此类化学物质存在于卵泡液中时，它们可直接影响排卵前在卵泡液中完成的卵母细胞成熟[3, 23, 24]。此外，人类和动物研究报告了化学物质暴露与女性不孕之间的关联[25, 26]。由于卵母细胞质量与早期胚胎发育密切相关，有毒化学物质引起的结构损伤可能导致细胞分化和器官系统形成失败[27]。例如，聚苯乙烯——一种常见的微塑料——已在不孕女性的卵泡液中被检测到，对其暴露通过诱导过度氧化应激，在人类和小鼠模型中破坏了卵泡液代谢并损害了卵母细胞质量[28]。同样，对人类发育有毒的重金属如汞和铅已在人类卵泡液中被检测到，它们对卵丘-卵母细胞复合体产生不利影响，最终影响妊娠结局[29, 30]。因此，评估这些化学物质对卵母细胞成熟的毒性效应变得越来越重要。卵母细胞体外成熟（IVM）是指取出的未成熟卵母细胞在特定培养环境中成熟的过程[31]。IVM是阐明女性配子形成机制的重要平台[32]，并推动人工育种、克隆和转基因动物生产[33]。啮齿动物、牛和猪长期以来一直被用作IVM模型。特别是，猪与人类在遗传、生理和发育时序等多个方面具有相似性[34-36]。猪也经历了与人类可比的进化历程，代表了一个表型多样的物种[37]。系统发育分析表明，人类基因组与猪基因组的距离大约比与小鼠基因组的距离近三倍[38]。此外，在形态和减数分裂阶段方面，猪卵母细胞与人类卵母细胞非常相似[37-40]。此外，猪卵母细胞在生殖研究中既具有伦理优势也具有实际操作优势，特别是考虑到实验动物的使用受到法规限制和社会担忧的制约[41]。由于未成熟卵母细胞取自卵巢（即肉类产业的副产物），该系统避免了实验动物的使用，从而支持了3Rs原则（替代、减少和优化）[42]。因此，猪越来越多地被认可并用作生殖研究模型[43, 44]。鉴于其生理上与人类的相似性，猪已被广泛用作外科手术和毒理学测试的模型[36, 38]。此外，猪卵母细胞成熟已被提议作为毒性筛选的可靠模型[44, 45]。各种化学化合物，包括环境污染物（如多氯联苯、氯丹和林丹）、金属（如砷和镉）和食品污染物（如黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和玉米赤霉烯醇），都会损害猪卵母细胞发育[46-49]。尽管已采用各种方法来评估化学化合物对猪卵母细胞IVM的毒性效应，但目前尚无关于评估指标的综合性总结。因此，在本综述中，我们提供了猪IVM系统和用于评估卵母细胞质量指标的整合性概述，包括其分类、基本原理和应用。## 内容片段### 猪IVM系统作为生殖研究模型卵母细胞成熟是一个专门的生物过程，对成功受精和后续胚胎发育至关重要[50]。该过程需要核成熟和胞质成熟两个方面；核成熟以极体排出为标志，而胞质成熟涉及线粒体功能、母源性RNA调控、细胞骨架组织和氧化还原控制，决定了卵母细胞的发育能力[51, 52]。鉴于这些独特特征和……### 卵丘细胞扩张在卵母细胞减数分裂恢复期间，卵丘细胞开始合成透明质酸（HA），并沉积在细胞外空间。这一过程被称为卵丘细胞扩张（CCE）[87]。足够的卵丘细胞层和适量的HA产生，随后是卵丘扩张，是卵母细胞成功成熟的必要条件[88]。因此，CCE的程度可以作为卵母细胞成熟质量的标志[89]（图1A-B）。CCE通常在立体显微镜下进行评估，使用……### 使用卵母细胞IVM指标进行生殖毒性评估的考量氧化应激、线粒体功能障碍、过度自噬和细胞凋亡的指标代表了卵母细胞中细胞应激反应的序贯级联。这些读数在机制上相互关联，并且通常按顺序被激活[281]。氧化应激已被认定为这一细胞应激反应级联的关键启动因素[282]。过多的活性氧（ROS）积累导致线粒体功能障碍，其特征包括膜电位降低、ATP产生减少以及……### 结论在本综述中，我们总结了用于评估化学化合物对猪卵母细胞IVM毒性效应的指标，并结合卵母细胞成熟讨论了其依据、基本原理和应用（总结见表1、表2）。正如引言和"第2节：猪IVM系统作为生殖研究模型"中所述，猪卵母细胞IVM与人类卵母细胞成熟具有多方面的相似性，并为实验研究提供了伦理优势。此外，……### CRediT作者贡献声明**Yeonjoo Lee：** 撰写——审阅与编辑，调查研究。**Yubyeol Jeon：** 撰写——审阅与编辑，调查研究。**Sanghoon Lee：** 撰写——审阅与编辑，验证，监督，项目管理，资金获取，概念构思。**Yumin Lee：** 撰写——初稿撰写，调查研究，概念构思。**Seunghyun Choi：** 撰写——审阅与编辑，调查研究。**Gyeonghyeon Kim：** 撰写——审阅与编辑，调查研究。### 利益冲突声明作者声明，他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性经济利益或个人关系。### 致谢本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF，由韩国政府[MSIT]资助）的资助（编号：00210823和25476079）。### 利益冲突声明作者声明不存在利益冲突。### 数据可用性数据可根据要求提供。---Yumin Lee | Seunghyun Choi | Gyeonghyeon Kim | Yeonjoo Lee | Yubyeol Jeon | Sanghoon Lee韩国大田忠南大学兽医学院动物繁殖实验室，大田 34134，韩国