《Results in Chemistry》：Huoxi Qufeng medicinal liquor alleviates rheumatoid arthritis lesions: Bioinformatic prediction of EGFR-related JAK-STAT/PI3K-Akt pathways and in vivo pharmacological validation
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活膝祛风药酒（HXQF）是一种临床用于治疗类风湿关节炎（RA）的中药复方，但其药效机制尚不明确。本研究旨在探究HXQF及其活性成分异欧前胡素（ISO）的抗RA作用及潜在分子机制。
研究人员通过网络药理学、分子对接、分子动力学模拟及体内药理学实验进行系统评估。网
活膝祛风药酒（HXQF）是一种临床用于治疗类风湿关节炎（RA）的中药复方，但其药效机制尚不明确。本研究旨在探究HXQF及其活性成分异欧前胡素（ISO）的抗RA作用及潜在分子机制。
研究人员通过网络药理学、分子对接、分子动力学模拟及体内药理学实验进行系统评估。网络药理学分析从HXQF中筛选出活性成分及其潜在靶点，并与RA疾病靶点取交集获得279个共同靶点。基因本体（GO）功能富集和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，HXQF的抗RA作用主要涉及肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、JAK-STAT信号通路和PI3K-Akt信号通路，其中表皮生长因子受体（EGFR）被鉴定为核心靶点基因。分子对接结果显示，ISO与EGFR（PDB ID: 1xkk）具有最优结合亲和力（结合能?8.3 kcal/mol），分子动力学模拟进一步证实ISO-EGFR复合物在100 ns模拟时间内保持稳定，可形成多达三个氢键。
体内药理学实验采用完全弗氏佐剂（CFA）诱导的SD大鼠RA模型，研究人员将大鼠随机分为对照组、模型组、布洛芬组、HXQF组和ISO组。结果显示，与模型组相比，HXQF和ISO干预均显著降低大鼠关节炎指数评分，减轻踝关节软骨侵蚀、滑膜组织增生及炎性细胞浸润。酶联免疫吸附测定（ELISA）结果显示，HXQF和ISO显著降低血清促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）及抗凝血酶III（AT-III）水平。
综上所述，HXQF可能通过其活性成分ISO与EGFR结合，抑制EGFR介导的下游JAK-STAT和PI3K-Akt信号级联通路，从而减轻RA炎症反应和关节病理损伤。ISO作为HXQF的关键活性成分，具有独立抗关节炎活性，是RA干预的潜在候选化合物。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种慢性系统性自身免疫性疾病，以侵袭性、对称性多关节炎为主要特征。其病理机制涉及免疫系统异常攻击滑膜组织，引发持续慢性炎症，活化的白细胞释放细胞因子诱导滑膜炎症，形成增生性血管翳，进而侵蚀关节软骨和软骨下骨，最终导致关节间隙狭窄、强直及不可逆的活动功能丧失。目前RA尚无根治性疗法，现有治疗策略包括非甾体抗炎药（NSAIDs）、糖皮质激素、传统改善病情抗风湿药（DMARDs）、生物制剂及手术干预。JAK抑制剂已显示出与传统生物DMARDs相当的临床疗效，PI3K-Akt信号通路因其在RA炎症反应、滑膜细胞增殖和血管生成中的多重调控作用而受到广泛关注。
活膝祛风药酒（HXQF）是临床用于治疗RA的经验方，疗效稳定且患者耐受性良好，但其药理学机制尚不清楚。前期研究已鉴定出HXQF的五个关键生物活性成分：异欧前胡素（Isoimperatorin, ISO）、羌活醇（Notopterol, NOT）、阿魏酸苯乙醇酯（Phenethyl ferulate, PF）、蛇床子素（Osthole, OST）和白花前胡素（Columbianadin, CBN）。其中NOT、PF、OST和CBN的抗RA作用已有文献报道，而ISO在RA治疗中的潜力此前未被研究。唯一相关证据来自Xu等人的研究，显示ISO通过靶向VEGFR2信号通路抑制血管生成。鉴于病理性血管生成是RA进展的标志性特征，研究人员假设ISO可能通过调控血管生成及相关炎症通路对RA发挥治疗作用。此外，与合成JAK/EGFR抑制剂（如托法替尼、厄洛替尼）相比，ISO作为天然产物具有内在生物相容性，可能提供更安全的治疗替代方案。
二、研究内容与主要结论
研究人员整合网络药理学、分子对接、分子动力学模拟及体内药理学实验，系统探究HXQF治疗RA的潜在机制及ISO的治疗潜力。研究发现HXQF及其活性成分ISO能够缓解CFA诱导的RA大鼠急性炎症病变和关节病理改变。生物信息学分析预测其抗炎作用可能与以EGFR为核心的JAK-STAT和PI3K-Akt信号级联通路相关。ISO单独给药即可独立减轻关节肿胀、病理损伤及血清促炎细胞因子水平，提示其作为独立抗关节炎药物的潜力。
三、关键技术方法
研究人员采用多学科交叉的技术策略。网络药理学方面，从TCMSP数据库和中药数据库筛选HXQF活性成分，通过Swiss Target Prediction预测靶点，与OMIM、GeneCards、NCBI Gene数据库获取的RA疾病靶点取交集，利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，Cytoscape 3.10.0进行拓扑分析和核心靶点筛选，并开展GO和KEGG富集分析。分子模拟方面，从RCSB PDB数据库获取EGFR蛋白结构（PDB ID: 1xkk），使用AutoDockTools 1.5.7进行分子对接，GROMACS 2024.3进行100 ns分子动力学模拟。体内实验方面，采用25只雄性SD大鼠（6–8周龄，180–220 g），随机分为对照组、模型组、布洛芬组（5 mg/kg）、HXQF组（2 mL，2 g/mL生药）和ISO组（50 mg/kg），通过左后足垫皮下注射完全弗氏佐剂（CFA）建立RA模型，给药7天后进行ELISA检测和踝关节HE病理切片分析。
四、研究结果
HXQF改善大鼠RA症状。 药理学实验结果显示，布洛芬组、HXQF组和ISO组均表现出不同程度的治疗疗效，直接证据为RA指数评分降低。其中布洛芬组效果最显著，HXQF组次之，ISO组也表现出良好疗效。RA影响模型大鼠摄食，所有佐剂诱导组均出现体重增长减缓趋势。
网络药理学预测HXQF对RA的良好治疗潜力。 研究人员获得816个HXQF靶点，与1837个RA疾病靶点取交集得到279个共同靶点。药物-成分-靶点-疾病网络包含362个节点（7味中药、76个化合物、279个潜在靶点）和1753条边。PPI网络分析揭示277个节点和5973条边，经拓扑筛选获得48个核心节点和978条边的子网络。GO分析显示生物学过程主要涉及凋亡过程负调控、平滑肌细胞增殖正调控、炎症反应和血管生成。KEGG富集分析显示主要涉及TNF信号通路、JAK-STAT信号通路和PI3K-Akt信号通路。分子对接结果显示，1xkk（EGFR）与所有配体的结合能均低于?7.7 kcal/mol，提示EGFR可能在HXQF抗RA疗效中发挥关键作用。
HXQF保护滑膜结缔组织免受RA诱导的关节结构异常。 HE染色结果显示，对照组关节结构正常，滑膜细胞完整无增生。模型组显示踝关节软骨严重侵蚀、滑膜结缔组织中度增生、成纤维细胞与结缔组织交错排列、广泛毛细血管增生及大量淋巴细胞浸润。与模型组相比，各药物治疗组踝关节软骨侵蚀和炎性细胞浸润显著减轻，滑膜组织增生和毛细血管增殖得到缓解。半定量病理评分显示，布洛芬、HXQF和ISO均降低关节病理损伤，其中布洛芬在7天短期干预内产生更轻微的組織病变。
HXQF降低RA大鼠炎症因子水平。 ELISA结果显示，与空白对照组相比，RA模型组血清促炎因子TNF-α（142.61±18.42 pg/mL vs 86.04±15.37 pg/mL）、IL-6（16.84±4.53 pg/mL vs 5.94±2.87 pg/mL）、IL-1β（136.30±22.51 pg/mL vs 98.80±13.24 pg/mL）及AT-III（116,012.78±21,567.34 pg/mL vs 57,275.49±12,345.78 pg/mL）均显著升高，表明RA模型建立成功。与模型组相比，各药物干预组均不同程度显著降低上述指标水平。值得注意的是，HXQF组的IL-6水平接近空白组基线水平。
五、讨论与结论
讨论部分指出，EGFR在RA病理进展中发挥关键调控作用。在滑膜组织中，EGFR异常激活可通过下游JAK-STAT和PI3K-Akt信号通路驱动滑膜成纤维细胞（FLS）的异常增殖、侵袭和炎性细胞因子分泌，加剧关节软骨和骨组织破坏。在巨噬细胞和T淋巴细胞等免疫细胞中，EGFR信号通路可通过调控促炎细胞因子释放放大局部关节炎症。研究人员提出工作假说：HXQF可能通过其活性成分（如ISO）与EGFR结合，抑制EGFR激活及其下游信号通路，从而发挥抗RA作用。分子动力学模拟显示ISO-EGFR复合物在25 ns至100 ns期间保持良好稳定性，可形成多达三个氢键，持续氢键网络和低结构波动反映ISO与EGFR口袋残基之间较强的结合驻留时间，为持续抑制下游JAK-STAT/PI3K-Akt级联提供结构基础。研究局限性包括：仅评估了HXQF和ISO的体内抗关节炎表现，未表征NOT、PF、OST和CBN的独立药效及协同关系；仅使用雄性SD大鼠；EGFR相关信号轴仅来自计算预测，缺乏滑膜组织磷酸化蛋白数据支持；仅采用单一剂量水平，无法得出剂量-效应相关性结论。
研究结论：结合网络药理学、分子模拟和短期体内药理学实验，研究人员发现HXQF和ISO可缓解CFA诱导的RA大鼠急性炎症病变和关节病理改变。生物信息学分析预测其抗炎作用可能与以EGFR为中心的JAK-STAT和PI3K-Akt信号级联相关。ISO、NOT、PF、OST和CBN是2025年版《中国药典》中羌活和独活的官方标志性成分。分子对接验证了五种单体与EGFR之间均具有稳定结合亲和力。ISO单独给药即可独立减轻CFA诱导的RA模型中的关节肿胀、病理损伤及血清促炎细胞因子水平，提示其作为独立抗关节炎药物的潜力；但其余四种成分（NOT、PF、OST和CBN）的直接协同贡献尚未在本研究中评估，有待对照联合给药实验阐明。
