整合实验与计算评估阿尔及利亚药用植物来源的HIHPT抗SARS-CoV-2及病原微生物活性

《Results in Chemistry》：Integrative experimental and computational assessment of HIHPT from Algerian medicinal plants against SARS-CoV-2 and pathogenic microbes

　　

研究人员从阿尔及利亚药用植物Launaea arborescens的地上部分分离出一种生物活性化合物HIHPT，并将其鉴定为4,4,6b,8a,11,11,14b-七甲基-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,14,14a,14b-二十氢化苉-3,5,8-三醇（HIHPT），一种含有三个羟基官能团的五环三萜类化合物。体外实验表明，HIHPT对多种致病性念珠菌（Candida）表现出显著的抗真菌活性，其中对克柔念珠菌（Candida krusei）的抑菌圈直径达35 mm，优于阳性对照两性霉素B（20 mm）；对白色念珠菌（Candida albicans）和葡萄牙念珠菌（Candida lusitaniae）的抑菌圈分别为28 mm和22 mm，而两性霉素B在相同条件下未检测到抑菌活性。生物膜抑制实验显示，HIHPT对白色念珠菌的抑膜率最高（46.54%），优于两性霉素B。密度泛函理论（DFT）分析在B3LYP/6-31G(d,p)水平下揭示了HIHPT的边界分子轨道分布、能隙（6.632 eV）、自然键轨道（NBO）电荷和分子静电势（MESP）特征，表明其具有合理的电子结构和分子稳定性。分子对接研究显示，HIHPT与SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）和细菌二氢蝶酸合酶（DHPS）的活性位点均能形成稳定结合，对接分数分别为?5.913 kcal/mol和?45.525 kcal/mol（结合能），与共晶配体相当。100 ns分子动力学模拟和MM-GBSA自由能计算进一步证实HIHPT与Mpro复合物在整个模拟过程中保持有利的负结合自由能（ΔG_bind约?22.73至?38.27 kcal/mol），表明其结合模式稳定。ADMET和类药性分析（PETRA、Osiris、Molinspiration）预测HIHPT具有可接受的理化性质、较低的毒性风险和良好的药物相似性，log P为4.56，固有溶解度（log S?）为?4.85（log mol/L），呈pH依赖性脂溶性特征。综上，HIHPT是一种有前景的天然先导化合物，值得进一步开展体内研究和临床评价以验证其治疗效能和安全性。

论文解读：阿尔及利亚药用植物来源的HIHPT抗SARS-CoV-2及病原微生物的多维评估

一、研究背景与问题

南部阿尔及利亚拥有丰富的植物资源，其中菊科（Asteraceae）药用植物种类繁多。 Launaea arborescens 广泛分布于阿尔及利亚西南部撒哈拉地区，传统上用于治疗癌症、胃肠道疾病、腹泻和发热等。尽管现代医学取得了显著进步，但人们对现有治疗药物的安全性和有效性仍存顾虑，包括部分药物的副作用、某些治疗手段的有限成功率以及医疗产品的高成本。因此，植物源性替代药物和补充疗法的使用显著增加。然而，药用植物单独使用或与其他药物联用时可能产生有害效应或不良相互作用，需要适当的法规和质量控制措施来确保其药学质量、安全性和疗效。天然产物是发现新活性化合物的重要来源，特别是五环三萜类化合物已被计算研究提示具有抗SARS-CoV-2潜力。然而，从该植物中分离出的特定化合物HIHPT的抗菌、抗真菌和抗病毒活性尚缺乏系统的实验与计算评估。因此，研究人员开展了整合实验和计算研究，以全面评价HIHPT的生物学活性和药物潜力。

二、研究内容与结论

研究人员从Launaea arborescens地上部分的二氯甲烷萃取物中，经硅胶柱层析分离纯化得到生物活性化合物HIHPT，经波谱数据分析鉴定为4,4,6b,8a,11,11,14b-七甲基-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,14,14a,14b-二十氢化苉-3,5,8-三醇（HIHPT），分子式C29H48O3。体外抗真菌实验表明，HIHPT对五种临床分离的念珠菌（Candida albicans, C. krusei, C. kefyr, C. lusitaniae, C. tropicalis）中的四种具有显著抑菌活性，特别是对克柔念珠菌的抑菌圈达35 mm，优于两性霉素B（20 mm）。生物膜抑制实验显示，HIHPT对白色念珠菌的抑制率最高（46.54%），整体抗生物膜能力优于两性霉素B。分子对接研究表明，HIHPT能与SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）和细菌二氢蝶酸合酶（DHPS）的活性位点稳定结合，与关键残基形成氢键和疏水相互作用。100 ns分子动力学模拟和MM-GBSA计算证实HIHPT-Mpro复合物保持稳定，结合自由能始终为负值。DFT计算揭示了HIHPT的前线分子轨道、能隙（6.632 eV）、NBO电荷分布和MESP特征，表明其具有合理的电子结构和化学稳定性。POM分析（PETRA、Osiris、Molinspiration）预测HIHPT具有可接受的药物相似性、较低的毒性风险和多种潜在的生物活性。脂溶性和溶解度研究表明，HIHPT在生理pH范围内主要以非离子化形式存在，log P为4.56，固有溶解度log S?为?4.85，呈现典型的中性高亲脂性分子的pH依赖性行为。总体结论是HIHPT是一种有前景的天然先导化合物，但需进一步体内研究和临床调查验证其疗效和安全性。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了多种关键技术方法。样品来源为阿尔及利亚大学医院微生物实验室提供的五种临床真菌分离株。实验方法包括索氏提取法、硅胶柱层析分离纯化、琼脂孔扩散法抗真菌活性测定、结晶紫染色法生物膜抑制实验。计算技术包括：基于Schr?dinger套件的分子对接（Glide SP协议），针对SARS-CoV-2 Mpro（PDB）和二氢蝶酸合酶（DHPS）进行；100 ns分子动力学（MD）模拟评估复合物稳定性；MM-GBSA方法计算结合自由能；Gaussian 09软件在B3LYP/6-31G(d,p)水平进行DFT量子化学计算；PETRA、Osiris和Molinspiration平台进行POM药物相似性分析；Marvin?软件计算pH依赖的脂水分配系数log D和溶解度log S。

四、研究结果分述

4.1 抗真菌活性
采用琼脂孔扩散法对HIHPT进行抗真菌活性评价。结果显示，HIHPT对克柔念珠菌抑菌圈为35 mm，远高于两性霉素B（20 mm）；对白色念珠菌为28 mm，而两性霉素B显示耐药（R）；对葡萄牙念珠菌为22 mm，两性霉素B同样为R；对热带念珠菌为16 mm，优于两性霉素B（8 mm）；对克菲念珠菌无活性。阴性对照DMSO对所有菌株均无活性。

4.2 体外生物膜形成抑制实验
采用结晶紫染色法评价HIHPT的抗生物膜活性。结果表明，HIHPT对白色念珠菌的抑制率为46.54%，克菲念珠菌为36.46%，葡萄牙念珠菌为33.87%，克柔念珠菌为30.90%，热带念珠菌为22.77%。两性霉素B仅对克柔念珠菌和热带念珠菌表现出弱抑制，其余菌株几乎无抑制。HIHPT的抗生物膜能力优于标准抗真菌药物。

4.3 分子对接
针对SARS-CoV-2 Mpro的对接显示，HIHPT的对接分数为?5.913 kcal/mol，结合能为?45.525 kcal/mol，与共晶配体甲基-4-氨磺酰基苯甲酸酯（?6.518和?47.112 kcal/mol）相当。HIHPT与Glu166和Pro168形成两个氢键，并与Met49、Met165形成疏水相互作用。针对DHPS的对接显示，HIHPT与Gln149形成两个氢键，并与Pro64、Lys221、Phe28等残基形成七个疏水相互作用，表现出强结合亲和力。

4.4 分子动力学模拟
对Mpro与阳性对照（System 1）及HIHPT（System 2）的复合物进行了100 ns MD模拟。System 1的Cα RMSD约2.4 ?，System 2约2.0 ?，均表明蛋白质构象稳定。RMSF分析显示接触残基波动均不超过6.0 ?。蛋白-配体相互作用分析表明，HIHPT与His41、Ser46、Asn142、Glu146、Gln189和Thr190等残基存在水桥介导的相互作用，其中Gln189和Thr190为两体系共同接触残基。疏水接触方面，HIHPT与Met65和Pro168相互作用。

4.5 MM-GBSA结合自由能分析
从100 ns轨迹中每隔5 ns提取20个快照计算结合自由能。阳性对照的ΔG_bind范围为?16.93至?42.96 kcal/mol（应变校正后?17.37至?44.01 kcal/mol），HIHPT的ΔG_bind范围为?22.73至?38.27 kcal/mol（应变校正后?23.73至?39.01 kcal/mol）。所有值为负，表明HIHPT与Mpro形成热力学稳定的复合物，虽弱于阳性对照，但维持了稳定的结合模式。

4.6 DFT量子化学研究
在B3LYP/6-31G(d,p)水平计算得到HIHPT的EHOMO为?6.036 eV，ELUMO为0.596 eV，ΔEgap为6.632 eV，与参考分子4MSB（5.524 eV）和4AMSB（5.407 eV）相近，表明反应性适中。NBO电荷分析显示，最正电荷位于氢原子H70和H80（0.481 ua），最负电荷位于氧原子O26（?0.769 ua）、O28和O32（?0.764 ua）。MESP分析表明羟基氢原子区域为正电位（亲电），氧原子区域为负电位（亲核）。

4.7 POM分析
PETRA分析显示HIHPT具有有利的电子电荷分布；Osiris预测cLogP约5.3，无致突变、致肿瘤、刺激性和生殖毒性风险，药物相似性分数?2.42，药物分数0.21；Molinspiration预测其作为酶抑制剂（0.63）和核受体配体（0.62）具有较好活性，GPCR配体活性中等（0.25）。

4.8 脂溶性和水溶性
HIHPT的固有log P为4.56，log D在pH 1–12范围内几乎恒定，表明其在生理pH范围内以非离子化形式存在并保持良好亲脂性；在pH 13–14出现下降，提示碱性条件下离子化增加。固有溶解度log S?为?4.85，属于低水溶性但可满足口服药物开发要求的范围。

五、讨论与结论总结

讨论部分指出，HIHPT的抗真菌活性可能来源于其含三个羟基的五环三萜骨架，能够与真菌细胞膜相互作用、破坏膜完整性并干扰必需细胞过程。其抗生物膜活性可能与干扰真菌细胞黏附、胞外聚合物（EPS）产生和生物膜成熟有关。分子对接和MD模拟结果一致表明HIHPT在Mpro活性位点形成稳定结合，MM-GBSA进一步证实了热力学有利的结合。DFT和POM分析共同支持HIHPT具有合理的电子特征和良好的药物相似性。研究人员总结认为，HIHPT是开发新型抗病毒和抗微生物药物的有前景的天然先导化合物，但需进一步开展体内研究和临床调查验证其治疗效能和安全性。