光环境与果实成熟度对墨西哥野生辣椒（Capsicum annuum var. glabriusculum）提取物抑制可可丛枝病菌（Moniliophthora roreri）的潜力研究

《Revista Argentina de Microbiología》：Antifungal potential of Capsicum annuum var. glabriusculum on Moniliophthora roreri in response to fruit maturity and shading during fruit growth

　　

丛枝病菌（Moniliophthora roreri）是一种半活体营养型植物病原真菌，是可可丛枝病（cacao moniliasis）的病原体，该病害严重影响了拉丁美洲的可可生产。该病害于1817年在哥伦比亚东北部首次报道，此后逐步扩散至南美洲和中美洲的14个国家。在墨西哥，丛枝病于2005年首次报道，目前在未管理种植园中造成75%至100%的产量损失，威胁着农户收入与可可种植的可持续性。M. roreri可在可可果实的任何发育阶段侵染。沉积在健康果实表面的孢子萌发后，通过角质层或气孔穿透果实，并在组织细胞间定殖。在其活体营养阶段，单核菌丝在细胞间生长，可改变籽粒发育并诱导果实肿胀；该阶段在接种后可持续45至90天。坏死营养阶段的起始特征为真菌呈现纤细、薄壁的胞内菌丝，迅速导致组织死亡；坏死营养菌丝细胞为单核，被视为单倍体。M. roreri诱导内果皮和中果皮坏死，随后扩展至果皮，初期形成细小油渍状斑点，随后在外果皮表面融合为深褐色斑点。褐色斑的扩展可能覆盖或未覆盖整个果穗，随后形成白色假菌丝束并进行真菌产孢。坏死并产孢的果实可在树上附着7至9个月，为新一季作物提供初侵染源或次侵染源。在不同防治方法中，栽培管理是控制丛枝病最常用的方法，包括每周清除病果、修剪和清园等措施。然而在墨西哥，由于劳动力成本高且生产者资金有限，这些措施未得到持续实施。另一种防治方法是施用杀菌剂，如嘧菌酯（azoxystrobin，1200 mg/l），其对丛枝病具有防效，可保护小果并治疗较大果实。然而，由于成本高且生产者培训不足，其在墨西哥的使用受到限制。遗传改良提供了最安全的长期防治手段，抗病且高产的可可无性系如CATIE-R1、CATIE-R4、CATIE-R6、CC-137、ICS-95和PMCT-58可供种植者选用。然而，对M. roreri的抗性可能因气候条件和树龄而变化。生物防治中，已评估木霉属（Trichoderma）真菌的体外拮抗效果，结果令人鼓舞，但该方法尚未经生产者验证和推广应用。作为可持续防治选项，植物提取物已被提出。来自C. annuum var. glabriusculum的酚类和类胡萝卜素化合物对链格孢（Alternaria alternata）和尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）等植物病原真菌的菌丝生长和产孢具有抑制作用。研究表明，C. annuum var. glabriusculum未成熟果实提取物体外抑制M. roreri发育和产孢的效果超过90%。然而，环境条件可能影响果实的植物化学成分组成和生物活性。C. annuum var. glabriusculum在多种光照条件下野生生长，主要分布于遮荫环境（如次生林、种植园和花园），也见于开阔阳光环境（如牧场和路边）。该物种的Amashito形态型在雨季和寒冷季节的70%遮荫条件下开花和果实产量最高。近年来，塔巴斯科州的森林砍伐和土地利用变化改变了农业生态系统结构和环境条件，促使本地辣椒通过形态、生理和植物化学变化进行适应。鉴于本地辣椒的文化和生态价值及其体外抗真菌活性，评估果实发育期间的光照暴露是否影响该活性，以及体外效果能否在体内重现，至关重要。因此，本研究旨在评价来源于三种光照条件下生长的C. annuum var. glabriusculum Amashito形态型未成熟和成熟果实的甲醇提取物（含酚类化合物）在体外抑制M. roreri菌丝生长和产孢的功效。此外，还评估了该提取物在塔巴斯科州两个可可种植园两个收获季节中降低M. roreri发病率的体内功效。

论文解读：野生辣椒提取物防治可可丛枝病的潜力及其光照与成熟度效应

一、研究背景与问题

可可丛枝病（cacao moniliasis）是由半活体营养型真菌Moniliophthora roreri引起的严重病害，自1817年在哥伦比亚东北部首次报道以来，已蔓延至南美洲和中美洲14个国家。2005年墨西哥首次报道该病，目前未管理种植园中产量损失高达75%至100%，严重威胁农户收入和可可产业可持续性。M. roreri可侵染可可果实任何发育阶段：孢子萌发后穿透角质层或气孔进入组织，活体营养阶段单核菌丝在细胞间生长并可持续45至90天；坏死营养阶段则产生薄壁胞内菌丝导致组织快速死亡，最终形成褐色病斑、白色假菌丝束并大量产孢。带病果实可在树上存留7至9个月，成为新一季作物的初侵染源。现有防治手段各有局限：栽培管理（每周清果、修剪、清园）因劳动力和资金限制在墨西哥难以持续；杀菌剂如嘧菌酯（azoxystrobin，1200 mg/l）虽有效但成本高且生产者缺乏培训；遗传改良虽提供抗病无性系（如CATIE-R1、ICS-95等），但抗性受气候和树龄影响；木霉属生物防治尚在体外阶段未获推广。因此，植物提取物作为可持续替代方案受到关注。已有研究表明，Capsicum annuum var. glabriusculum（野生辣椒）的酚类和类胡萝卜素化合物能抑制链格孢和尖孢镰刀菌等病原真菌，未成熟果实提取物体外抑制M. roreri效果超过90%。然而，环境条件特别是光照可能影响果实植物化学成分与生物活性。该物种在墨西哥塔巴斯科州主要生长于70%遮荫环境，但近年来森林砍伐和土地利用变化迫使辣椒产生适应性改变。在此背景下，研究人员提出以下问题：果实发育期间的光照条件是否影响提取物抗真菌活性？体外抑制作用能否在田间条件下重现？本研究因此系统评估了不同光照（全光照、35%遮荫、70%遮荫）和果实成熟度（未成熟、成熟）条件下野生辣椒果实甲醇提取物对M. roreri的抑制效果，并在两个可可种植园开展田间验证。

二、研究内容与结论

研究人员于2021年3月至7月在墨西哥塔巴斯科州Huimanguillo采集不同遮荫条件下生长的Amashito形态型野生辣椒未成熟（绿色）和成熟（红色）果实，制备总酚提取物。在体外试验中，测定不同浓度（0.5–2.5 g/l）提取物对M. roreri菌丝生长和产孢的抑制率；通过高效液相色谱（HPLC）定量酚酸成分。离体试验使用田间自然感染M. roreri的可可果实切片，评价一次或两次提取物施用对病害严重度和产孢量的影响。田间试验于2022年雨季（8–10月）和冷锋季（11–12月）在两个可可种植园进行，分别选用墨西哥Trinitario复合基因型（约2月龄果实）、INIFAP 8和Carmelo基因型（约3月龄果实），设置预防性施用（接种前3天）和治疗性施用（接种后3天）两种方式，比较50%和100%浓度提取物与嘧菌酯及未处理对照的效果。研究得出以下主要结论：未成熟果实提取物在2.0–2.5 g/l浓度下对菌丝生长抑制率超过80%，成熟果实仅最高浓度达70%以上；提取物对孢子产孢的抑制率在1.5–2.5 g/l浓度下均超过80%。离体试验中，单次施用未稀释提取物将病害严重度降至45.44%，抑制产孢率达68%；二次施用后两种浓度抑制率均超过80%。田间试验中，提取物在三个基因型上的防效均大于50%，其中墨西哥Trinitario复合基因型反应最佳，INIFAP 8次之，Carmelo最差；施用未稀释提取物并在接种前3天处理（预防效果）显著提高防效，部分处理与嘧菌酯相当。该研究首次系统证明了野生辣椒提取物在田间条件下对可可丛枝病的防治潜力，且明确了光照条件和果实成熟度对抗真菌活性的影响规律，为该植物源杀菌剂的开发提供了理论依据和田间应用参数。

三、主要技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：（1）总酚提取物制备：采用80%甲醇以1:10（w:v）比例提取未成熟和成熟果实粉末，经60℃蒸发溶剂后用水复溶，酚类化合物总量按Singleton法以没食子酸当量（GAE）定量。（2）高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-DAD）定量酚酸：使用Nucleosil 100 A°反相色谱柱，流动相为pH 2.5三氟乙酸水溶液和乙腈二元系统，在254、280、330 nm波长下检测12种酚酸标准品。（3）体外抗真菌评价：将不同浓度提取物加入培养基，测定M. roreri菌落半径（游标卡尺正交测量）和产孢量（Neubauer计数板），按Abbott公式计算抑制率。（4）离体可可果实切片试验：从田间采集自然感染M. roreri的可可果实，消毒后切1 cm厚切片，喷雾施用提取物，用ImageJ软件分析病斑面积百分比并计数孢子。（5）田间预防/治疗试验：用1.2×10?孢子/ml悬浮液接种可可果实，提取物分别在接种前3天或接种后3天喷雾施用，统计病果率和健康果数，按Abbott公式计算防效。样本来源包括墨西哥塔巴斯科州两个可可种植园（Huimanguillo和Cunduacán），实验设计采用完全随机或随机区组设计，方差分析后以Tukey多重比较检验差异显著性。

四、研究结果

（1）酚酸含量随成熟度变化：未成熟果实中丁香酸（syringic acid）、没食子酸（gallic acid）和原儿茶酸（protocatechuic acid）含量最高（分别为267、212和82 μg/g）；成熟果实中未检测到原儿茶酸，没食子酸浓度升至1000 μg/g以上，丁香酸含量相近。遮荫百分比对酚酸含量无显著影响。（2）体外抑制菌丝生长：未成熟果实提取物在2.0和2.5 g/l浓度下抑制率高于80%，成熟果实仅2.5 g/l时超过70%，且35%遮荫条件下生长的成熟果实提取物抑制率不超过50%。（3）体外抑制产孢：未成熟和成熟果实提取物在1.5–2.5 g/l浓度下产孢抑制率均超过80%；70%遮荫条件下生长的果实在1.0 g/l浓度即获得70%以上抑制率。（4）离体切片防病：单次施用未稀释提取物使病害严重度降至45.44%，即减少54.56%的病斑扩展；二次施用后50%和100%浓度均使产孢抑制率超过80%，与10%尿素处理无显著差异。（5）田间防效：嘧菌酯在Trinitario复合基因型上防效达80%以上，但在Carmelo和INIFAP 8雨季防效低于70%，冷锋季超过80%；提取物处理中，未稀释提取物在接种前3天施用对Trinitario复合基因型防效超过55%，对INIFAP 8防效超过60%且与嘧菌酯相当；Carmelo基因型所有提取物处理防效均低于50%。总之，提取物预防性应用（接种前3天）效果优于治疗性应用，且未稀释浓度更有效，效果因可可基因型而异。

五、讨论与结论

讨论部分指出，植物提取物中多种酚酸（绿原酸、没食子酸、阿魏酸、迷迭香酸等）具有已知抗真菌活性，且可能与其他酚类和黄酮类化合物协同作用。未成熟果实提取物活性更强，可能与相对丰度和协同效应而非单一化合物浓度有关。酚酸的作用机制是干扰真菌细胞膜和细胞壁，阻止生长和增殖。田间防效低于体外试验的原因包括：田间条件存在其他病原菌互作、环境变化、病原毒力增强等；宿主防御反应也可能被诱导，酚类化合物可作为激发子激活植物防御机制，如积累病程相关蛋白、加固细胞壁和激活氧化防御通路，这解释了预防性施用效果的提升。结论部分总结：未成熟果实甲醇提取物体外抑制M. roreri生长和产孢，2.5 g/l浓度下无论光照条件均具抑制活性；提取物具有抗产孢作用，单次施用即可降低可可果实切片上的病害严重度和孢子数，二次施用效果增强；田间试验中提取物防效大于50%，Trinitario复合基因型响应最佳，其次是INIFAP 8和Carmelo克隆，且接种前3天施用可改善防效，表明具有预防效果。该研究为开发基于野生辣椒果实的植物源杀菌剂提供了田间验证基础，对可持续防控可可丛枝病具有重要意义。