基于石墨烯的双频太赫兹超表面生物传感器用于神经元特异性烯醇酶敏感检测

《Sensors and Actuators A: Physical》：Graphene-based dual-band terahertz metasurface biosensor for sensitive detection of neuron-specific enolase

　　

• 开发了一种石墨烯功能化的双波段太赫兹超表面生物传感器。
• 纳米压印技术实现了超表面的精确且可重复的制造。
• 双共振特性实现了对 1–50 ng/mL 范围内神经元特异性烯醇化酶（NSE）的敏感检测，检测限低至 0.17 和 0.60 ng/mL。
• 该生物传感器表现出高选择性、可重复性和良好的稳定性。

引言
神经元特异性烯醇化酶（NSE）是一种关键的细胞质标志物，主要存在于神经元和神经内分泌细胞中，同时也存在于红细胞和血小板中。NSE 是一种 γ-烯醇化酶同工酶，分子量约为 78 kDa，等电点约为 4.7。NSE 并非蛋白酶，而是作为糖酵解酶，催化 2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸 [1], [2], [3]。作为糖酵解途径中的关键酶，NSE 在神经组织和神经内分泌组织中高度表达 [4]。

由于细胞损伤或恶性转化会导致 NSE 释放进入循环系统，血清 NSE 已被广泛研究作为一种临床相关生物标志物。血清 NSE 也是胃肠胰神经内分泌肿瘤（GEP-NETs）患者的重要肿瘤标志物，其中约 30%-50% 的病例观察到血清 NSE 水平升高，且与肿瘤负荷和疾病进展相关 [5], [6]。近年来，神经内分泌肿瘤的发病率呈上升趋势。NSE 被广泛认为是卒中神经元损伤的生物标志物，也是小细胞肺癌和脑损伤疾病严重程度的临床指标 [7], [8], [9]。此外，它还是评估脑损伤程度和小细胞肺癌进展的预后生物标志物。因此，敏感可靠地定量 NSE 对于早期诊断、疾病评估和治疗监测具有重要意义。

在医学诊断和研究中，检测 NSE 的常用方法包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫放射测定（IRMA）、电化学发光免疫测定（ECLIA）和免疫荧光测定 [10]。通常，生物传感器将生物识别元件（如抗体、酶、核酸或受体）与物理化学转换器集成在一起，将特定的生物分子相互作用转化为可测量的信号。因此，生物传感器的分析性能取决于识别元件的特异性和信号转导机制的敏感性。ELISA 因其简单和经济而得到广泛应用；它通过抗原 - 抗体结合后接显色反应来定量 NSE。然而，它涉及复杂的程序，需要精确的温度控制，并且依赖熟练的技术人员 [11]。免疫放射测定（IRMA）使用放射性标记抗体来实现 NSE 的高灵敏度定量，但需要专门的放射性材料处理设施。电化学发光免疫测定（ECLIA）是一种较新的方法，使用电化学发光抗体标签提供高灵敏度检测，并支持宽的动态范围 [12], [13], [14]。免疫荧光测定通过荧光标记抗体检测 NSE，通常通过荧光显微镜或流式细胞术进行 [15], [16]。然而，ECLIA 和免疫荧光技术都有一定的局限性，包括依赖复杂仪器、信号输出不稳定、样品处理复杂以及成本相对较高。这些局限性促使开发了快速、无标记、高灵敏度且适用于微型检测系统的替代生物传感平台。

随着光谱无损检测技术的最新进展，光谱检测已成为生物标志物分析的一种有前途的替代方法。近年来，由于独特的物理性质，太赫兹（THz）光谱学得到了快速发展，在成像、通信和生物传感等尖端领域找到了广泛应用 [17], [18], [19], [20], [21], [22]。THz 光谱学以低散射、高穿透深度和独特的分子指纹识别能力为特征。其非接触和无标记的优势，通过利用太赫兹范围内生物分子的低光子能和特征吸收光谱，实现了对化学物质和生物分子的高效识别 [23], [24], [25]。特别是，THz 吸收光谱在小分子识别方面显示出显著潜力，并已广泛应用于核酸、蛋白质和其他生物标志物的检测，为 THz 生化传感器的发展奠定了坚实基础 [26], [27], [28], [29]。然而，天然蛋白质分子与 THz 波之间的微弱固有相互作用通常导致信号响应低，从而限制了检测灵敏度。为了解决这一局限性，引入人工工程的超表面已成为增强 THz 波与目标分析物之间耦合的有效策略。超表面是由以周期性或准周期性方式排列的亚波长共振元件组成的二维人工电磁结构。通过定制这些元件的几何形状、尺寸、对称性和空间排列，超表面可以操纵入射电磁波的振幅、相位、偏振和光谱响应。超表面可以表现出独特的电磁响应，包括有效负介电常数或磁导率、强共振吸收和亚波长场约束，从而实现增强电磁波操纵 [30], [31], [32], [33], [34], [35]。特别是，基于石墨烯的吸收体引起了相当大的关注，因为它们的电磁响应可以被设计成实现窄带或宽带吸收以及单波段或多波段特性 [36], [37], [38]。

此外，超表面在电磁响应调制方面表现出出色的性能，使其非常适合高阶模式控制和高灵敏度检测场景 [39], [40], [41], [42], [43], [44]。通过调节单位结构的几何尺寸和形态，可以诱导多种共振模式，导致强局域化电磁场和高品质因子共振 [45], [46], [47]。当分析物被引入这些高场区域时，其介电性能或折射率的变化会扰乱局部电磁环境，导致共振频率、振幅或线宽发生可测量的变化。这构成了基于超表面的生物传感器的基本传感机制。

超表面生物传感器结合了共振电磁结构的强场增强能力和表面生物识别的分子特异性，提供了紧凑、易于集成、低样品消耗和相对较低的制造成本等优势。THz 波的近场电磁能量可以在超表面结构内形成高度局域化的分布，与目标分析物发生强相互作用。耦合强度取决于分析物的物理化学性质，从而显著增强整体传感性能 [48]。由于生物分子结合改变了共振元件周围的局部介电环境，结合事件可以被转换为可检测的光谱偏移或共振强度变化。这种电磁协同作用赋予了系统对入射 THz 波的精确控制，并为高灵敏度无标记生物传感提供了物理基础。

在此基础上，超表面结构的表面功能化可以进一步提高识别和选择性。例如，Hassan 等人将抗 SARS-CoV-2 刺突蛋白抗体固定在等离子体超表面模板上，通过与病毒表面蛋白的特异性结合，实现了病毒的高选择性捕获 [49]。他们的设计将开口环谐振器结构与功能化的金纳米颗粒集成在一起，每个颗粒与特定抗体共轭，形成一个高度靶向的识别系统。Dong 等人开发了一种基于连续谱准束缚态（QBIC）的 THz 超表面生物传感器，用于低浓度生物样本的敏感检测 [50]。Wang 等人提出了一种基于相变材料的电可调超表面吸收体，用于宽带分子指纹识别 [51]。该结构由硫掺杂相变材料组成，在中红外区域表现出低吸收损耗 [52]。通过激发表面等离子体共振，传感器有效地在衍射极限内操纵光的传播，增强了局部电磁场强度和共振响应 [53], [54]。这种可调传感器在检测各种分子签名和实现精确化学识别方面表现出巨大潜力。总之，这些研究表明，共振超表面与表面特异性生物识别的结合可以同时增强电磁灵敏度和分子选择性。尽管取得了这些进展，现有的 THz 超表面生物传感器仍面临一些局限性。特别是，许多报道的方法主要依赖于单一共振响应，这可能限制生物分子识别的鲁棒性和可靠性，并提供不足以进行交叉验证的光谱信息。因此，开发一种双波段超表面生物传感器，在保留特异性分子识别的同时提供多种独立的光谱特征，对于可靠的 NSE 检测来说是高度理想的。

本研究提出了一种具有双波段吸收特征的表面功能化双模等离子体 - 激子太赫兹（THz）超表面生物传感器。拟议设计的关键创新在于集成了两条平行金属条的 C 形共振单元，它增强了单元内的电磁耦合，增强了局部场约束，并支持激发两种不同的共振模式。该器件由集成两个共振单元和表面功能化石墨烯层的周期性矩形框架构成。由此产生的双波段响应为分析物检测提供了两个独立的光谱特征，从而与单共振读出相比提高了生物分子传感的可靠性。双波段超表面结构采用纳米压印技术制造，随后在其表面上引入功能修饰。目标蛋白质通过与功能单元结构的共价或非共价相互作用被捕获。传感器通过监测目标结合区域周围介电环境的变化来检测分析物浓度，从而调节 THz 波与超表面之间的相互作用以增强信号响应。

方案 1. (a) 使用功能化石墨烯的膜制造过程。(b) 结合压印技术的功能化石墨烯超表面生物传感器检测平台设计。

这种增强源于分子 - 表面相互作用。设计的结构与入射 THz 辐射强耦合，在不同频率处产生两个局域化共振吸收峰，从而产生双频吸收响应。如图方案 1 所示，该生物传感器在两个等离子体共振处表现出明显的频移，表明其具有高的检测灵敏度。各种蛋白质的特异性和重复性实验证实了其优异的选择性和稳定性。石墨烯功能化生物传感器对 1 ng/mL 至 50 ng/mL 范围内的神经元特异性烯醇化酶（NSE）浓度显示出良好的线性响应，两个吸收带的检测限分别低至 0.17 ng/mL 和 0.60 ng/mL。该方法提高了检测效率并实现了快速检测，与临床诊断和决策的传统方法相比具有显著优势。

章节片段
NSE THz 超表面传感器的制造
在本研究中，设计了一种表面功能化的聚合物 - 石墨烯 - 金属超表面结构，在 THz 频率范围内表现出双吸收峰。THz 传感器由三个主要部分组成：聚合物薄膜、石墨烯层和骨架化金属结构。涂覆有石墨烯层的聚合物薄膜作为超表面组装的基底。在预处理阶段，表面功能化石墨烯被旋涂到聚合物薄膜上，该薄膜具有

THz 超表面生物传感器的描述
为了开发一种在 THz 频率范围内具有双吸收峰的传感器，我们设计了一种由聚合物介电层、表面功能化石墨烯和金属层组成的超表面结构。如图 1 所示，该传感器由多层超表面组成，包括图案化铜阵列、功能化石墨烯层和 PO（聚烯烃）薄膜。图 1a 中的三维示意图说明了器件的空间构型，其中铜箔

结论
本研究提出了一种基于双吸收峰策略的创新且超高灵敏度的 NSE 检测 THz 超表面生物传感方法。通过纳米压印辅助石墨烯修饰，成功实现了功能图案化和表面功能化的协同集成。所得生物传感器表现出从 1 ng/mL 到 50 ng/mL 的宽检测范围，两个特征

CRediT 作者贡献声明
Wenwen Sun：软件，数据整理。Yunzhe Jia：项目管理，调查。Chun-Sheng OuYang：项目管理。Hao Bi：软件，方法学，形式分析。

利益冲突声明
作者声明他们没有利益冲突。

致谢
作者们感谢研究组所有成员提供的有益讨论。本研究未获得资金支持。
Wenwen Sun 拥有博士学位，隶属于北京信息科技大学。她的研究兴趣包括人工智能、视觉感知和生物医学检测。
Wenwen Sun|Yunzhe Jia|Chun-Sheng OuYang|Hao Bi