《Small Methods》：Liquid Phase Backscattered Scanning Electron Microscopy of Bacillus subtilis Spores
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背散射电子扫描电镜（BSE-SEM）可提供成分对比度成像，但由于生物样本组成元素之间原子序数差异小、周围环境厚度大以及样品制备复杂等原因，该方法在生物样本中的应用十分有限。此前的石墨烯封装扫描电镜研究已实现了对水合态细菌的成像，主要目的在于保持或观察细菌形态。
背散射电子扫描电镜（BSE-SEM）可提供成分对比度成像，但由于生物样本组成元素之间原子序数差异小、周围环境厚度大以及样品制备复杂等原因，该方法在生物样本中的应用十分有限。此前的石墨烯封装扫描电镜研究已实现了对水合态细菌的成像，主要目的在于保持或观察细菌形态。在本研究中，研究人员建立了一种液相背散射电子扫描电镜（LPBSEM）方法，作为一种具有深度敏感性、无需标记的技术，用于可视化完整水合态细菌及枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）孢子的亚表面结构。该方法无需染色，即可在水合态样本中实现亚细胞结构的高对比度可视化。研究人员观察到了枯草芽孢杆菌孢子内部的结构层次，其形态与常规薄切片透射电镜（TEM）所观察到的结构相似，但无需进行可能损害样本完整性的样品制备。研究人员进一步研究了束能量对相互作用体积深度及图像对比度的影响，并提出了亚表面可视化的最优条件。研究人员使用蒙特卡洛模拟评估了所观察到的对比度变化趋势是否与预期的背散射分布一致，并为水合态低原子序数样本中背散射电子（BSE）的产生提供了物理解释框架。
论文解读
一、研究背景与意义
透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）已被广泛用于分子尺度上的生物结构可视化。然而，TEM要求薄切片处理，并可能需要重金属染色或聚焦离子束（FIB）铣削，这些样品制备步骤均存在引入伪影的风险。相比之下，SEM通过两种主要信号实现纳米级分辨率的表面敏感成像：二次电子（SE）信号对表面形貌特征敏感，而背散射电子（BSE）信号提供成分对比度。尽管BSE-SEM具有成分成像优势，但由于生物样本中组成元素的原子序数差异小、周围介质（如包埋树脂或冷冻制备中的玻璃态冰）厚度大导致信噪比（SNR）降低，该方法在生物样本中的应用受到限制。此外，传统生物样本制备方法如免疫金标记或四氧化锇染色虽可增强局部对比度，但可能改变或掩盖超微结构细节。
液相电子显微镜技术的进展为在不需重金属染色或脱水的情况下成像水合态生物样本提供了新机遇。石墨烯液体池（GLCs）通过将样本封装在薄的电子透明膜内，在接近天然状态下保护和稳定样本，同时最小化束诱导损伤和荷电伪影。尽管液相TEM已被广泛探索，液相SEM的发展相对滞后。此前基于石墨烯的细菌SEM研究主要聚焦于SE形态成像，而本研究建立了液相背散射电子扫描电镜（LPBSEM）作为无需标记的亚表面成像方法。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）孢子因其多层结构已被充分表征而成为理想的研究模型。孢子由致密的核心及围绕其周围的同心层状结构组成，包括皮层（一层厚的肽聚糖）和孢子衣。孢子衣可进一步区分为内层衣和外层衣两个蛋白质亚层。孢子各层组成不同：孢子衣主要由C、H、O、N组成，含少量S和P；皮层富含肽聚糖；核心含有DNA、RNA、酶和高水平的吡啶二羧酸钙（CaDPA）。这些组成差异不仅定义了各层的生物学功能，还强烈影响各层与入射电子束的相互作用方式。然而，孢子过厚，无法在不切片或FIB铣削的情况下通过常规TEM成像。因此，开发一种能够在水合态下可视化完整孢子内部结构的方法具有重要意义。
二、研究内容与主要技术方法
研究人员开发了一种在常规SEM仪器中进行液相背散射电子扫描电镜（LPBSEM）成像的样品制备方法。通过最小化石墨烯液体池（GLCs）中的液体和电子束路径，该方法能够从内部结构产生BSE对比度。主要关键技术方法包括：
- 1.
单晶单层石墨烯制备：采用化学气相沉积（CVD）法在多晶Cu箔上生长单晶单层石墨烯，通过无接触退火方法将多晶Cu箔热转化为单晶Cu(111)箔。
- 2.
石墨烯封装：使用醋酸丁酸纤维素（CAB）将CVD石墨烯转移到TEM网格上，通过湿法转移工艺将孢子封装在两层石墨烯之间，形成薄液层密封环境。
- 3.
SEM成像：使用JIB-4700F多束系统（JEOL，日本），在5、10或15 keV加速电压下同时采集SE和BSE信号，扫描时间为20秒，1280×960像素，工作距离6.0–8.5 mm，探针电流250 pA。
- 4.
蒙特卡洛模拟：使用CASINO V2.51软件模拟不同加速电压下的电子相互作用体积，验证实验成像条件和对比度。模拟样本基于孢子各层的厚度、组成和密度参数构建。
- 5.
拉曼光谱：使用WITec GmbH仪器，488 nm激光，1.0 mW功率，用于石墨烯表征。
三、研究结果
3.1 水合作用对结构完整性与对比度的影响
研究人员通过对比石墨烯封装（水合态）和空气干燥（脱水态）的孢子样本，发现封装在GLCs中的孢子保持了水合形态，能够可视化平行于电子束方向的不同亚细胞层。相比之下，常规SEM成像中因柱真空导致脱水的孢子表现出形态塌陷和超微结构细节的丧失。BSE图像中的强度分布（图2B、D）与孢子不同区域的局部密度或元素组成相关。水合态孢子的线剖面显示明显的对比度变化，对应核心、皮层和孢子衣的清晰峰；而脱水态孢子显示均匀的低对比度，无内部结构分化。沿长轴测量各主要孢子层的近似厚度为：孢子衣约157±10 nm，皮层约120±5 nm，核心约805±20 nm。研究人员还观察到一个约15 nm厚的明亮膜样结构，根据其厚度和位于孢子最外层的位置，推测为最外层富含聚糖的壳层（crust）。水合态孢子的总长度为1486±53 nm，脱水态为1305±49 nm，表明脱水导致孢子收缩约12%。SE与BSE成像对比显示，SE成像主要揭示表面形貌，内部层次区分度低；而BSE成像提供增强的深度信息，可揭示SE图像中无法分辨的亚表面特征。研究人员还确认了孢子封装在纯水中也能观察到对比度，排除了磷酸盐缓冲液（PB）对对比度的贡献。
3.2 束能量对穿透深度与图像对比度的影响
研究人员通过改变加速电压（5、10、15 keV）研究了束能量对成像的影响。使用Kanaya-Okayama公式估算电子穿透深度：5 keV时约635 nm，10 keV时约2019 nm，15 keV时约3974 nm。由于完整孢子厚度约750–1000 nm，5 keV以上的束能量可穿透整个孢子体积。实验结果显示，5 keV时边缘更清晰但核心较暗且分辨率差；随着束能量增加，核心变亮但孢子衣边界变得不那么清晰。蒙特卡洛模拟（CASINO）证实了这些观察：5 kV时BSE信号强烈偏向表面，峰值出现在外衣和内衣层，在约200 nm后迅速衰减；10 kV时背散射分布变宽，最大信号来自皮层和核心上部区域；15 kV时背散射产生量最高，包括来自整个孢子深度核心的信号，但靠近表面层的相对贡献减少。这些结果表明可以通过调节束能量来针对样本内特定感兴趣区域调整对比度。
3.3 枯草芽孢杆菌孢子萌发——动态过程的快照
研究人员使用标准L-丙氨酸萌发方案对孢子进行萌发处理，并在不同时间点（5分钟、20分钟和1小时）使用LPBSEM成像。由于孢子萌发具有固有的异质性和异步性，不同孢子所处的萌发阶段各不相同。在休眠状态，孢子呈现高度有序的多层结构，孢子衣、皮层和核心之间具有明显对比度差异。萌发早期，孢子整体形态基本不变，核心与皮层边界仍有残留可见，表明核心膨胀尚未完成。在核心-皮层边界周围观察到两个局部强度降低区域，这可能反映皮层降解导致的局部密度下降。萌发后期，孢子逐渐失去明显的层状结构，内部结构趋于均质化，这与皮层持续降解和核心水合作用增加一致。在完全萌发的孢子中，观察到肿胀的均质结构，核心完全扩展至最外层膜。此外，研究人员还成像了营养态枯草芽孢杆菌细胞和分裂中的细胞，显示细胞内部区域有清晰的超微结构细节，包括可能的拟核相关区域。
四、讨论与结论
讨论部分总结：LPBSEM方法结合了石墨烯封装与BSE-SEM的优势，能够在室温下以最小样品制备实现水合态生物样本的高对比度成像。与以往的石墨烯封装研究主要展示水合态SEM成像或液相TEM不同，LPBSEM利用背散射电子信号提供完整水合态生物样本的无标记亚表面成像。该方法保留了常规SEM平台的可及性，同时通过保持水合状态和最小化制备伪影，为研究微生物学中的动态过程提供了初始平台。该方法还可推广至水合态哺乳动物系统的研究，包括细胞-细胞界面、膜动力学、囊泡运输以及脂质递送系统等需要保持天然水合环境以理解功能的研究领域。
结论部分翻译：研究人员使用LPBSEM方法，将石墨烯封装与BSE-SEM相结合，实现了在室温下以最小样品制备对水合态生物样本的高对比度成像。具体而言，在薄液层封装内，研究人员成像了孢子萌发过程中内部结构的变化，无需染色或荧光标记即可获得潜在皮层降解的见解。以枯草芽孢杆菌孢子为模型系统，研究人员证明该方法能够保持水合状态，防止收缩和塌陷等伪影，并揭示孢子内部结构，包括核心、皮层和孢子衣。通过改变加速电压，研究人员进一步证明可以调节内部特征的对比度，这一结论得到了蒙特卡洛模拟的证实。
