基于昆虫嗅觉仿生的生物杂合传感器阵列用于红棕象甲聚集信息素选择性气相检测与早期监测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Insect olfaction-inspired biohybrid sensor array for selective airborne pheromone detection and early monitoring of invasive Rhynchophorus ferrugineus

　　

本研究报道了一种生物传感器阵列，用于灵敏检测入侵性害虫红棕象甲（Rhynchophorus ferrugineus）的信息素组分ferrugineol。该传感器以R. ferrugineus信息素受体嵌入脂质纳米盘（lipid nanodiscs）并与气味结合蛋白（odorant-binding proteins, OBPs）共同固定于石英晶体微天平（quartz crystal microbalance, QCM）换能器上制备而成，实现了对ferrugineol的气相检测，检出限达60 ppb，且具有优异的选择性。该传感器能够在田间实时检测被象甲侵染的棕榈树释放的ferrugineol，并在环境储存条件下保持完整功能超过七个月。该传感器在田间红棕象甲侵染的早期检测与监测方面具有潜在应用价值。

研究背景与科学问题

过去五十年间，全球化进程加速了多种入侵性昆虫物种向新地理区域的引入与定殖，这些物种已成为造成全球范围内严重生态与经济损失的破坏性农业害虫。棕榈贸易的直接后果之一是红棕象甲（Rhynchophorus ferrugineus, RPW）和南美棕榈象甲（R. palmarum）的迅速扩散。这两种物种均被联合国粮农组织（FAO）和欧洲及地中海植物保护组织（EPPO）列为A2风险等级的检疫性害虫，需严格监管以防止进一步扩散。R. ferrugineus原产于南亚、东南亚和美拉尼西亚，现已扩散至49个国家，威胁包括联合国教科文组织世界遗产在内的棕榈生态系统。其寄主范围从1950年代的4种棕榈科植物扩大到2020年的40余种。一旦象甲侵入棕榈树，幼虫隐匿于树干内取食内部组织，若无早期检测，侵染将不可避免地导致寄主树死亡。现有检测方法——包括目视检查、信息素诱捕和训练有素的探测犬——劳动强度大、成本高，且在早期阶段不可靠。新兴的光学传感器、声学监测和基于机器学习的分类系统仍受限于准确性、成本和现场部署能力。因此，迫切需要开发有效的早期检测与监测技术。

研究内容与意义

研究人员利用源自象甲化学感觉系统的生物识别元件，展示了一种能够灵敏检测与被侵染棕榈树相关的挥发性聚集信息素的生物杂合传感器。通过整合具有不同结合亲和力的蛋白质变体，创建了一个能够区分信息素挥发物与背景植物挥发物及利它素的传感器阵列。该便携式仿生检测平台为红棕象甲侵染的早期检测与实时监测提供了实用且可持续的工具，对综合虫害管理项目具有直接意义。

关键技术方法

1. 1.
   计算机模拟突变与分子对接筛选：利用I-TASSER服务器进行同源建模预测RferOBP1768和RferOBP23的三维结构；采用CASTp网络服务器识别结合口袋；使用PoPMuSiC算法评估单点氨基酸替换对蛋白质稳定性的影响（稳定突变需满足负的ΔΔG值）；通过Swissdock服务器进行配体与野生型（WT）及突变体蛋白的虚拟对接筛选。
2. 2.
   荧光竞争结合实验：使用荧光探针N-苯基萘-1-胺（1-NPN）测定OBPs与目标分析物的解离常数（K_D）。
3. 3.
   无细胞表达与纳米盘整合：将RferOR1在基于大肠杆菌的无细胞表达系统中表达，并整合入两种尺寸的脂质纳米盘中——MSP1D1（直径约8 nm）和MSP1E3D1（直径约13 nm），分别记为OR1₁和OR1₂。
4. 4.
   QCM生物传感器制备：将OBPs通过自组装单分子层（SAM）固定在20 MHz QCM换能器上；RferOR1纳米盘则直接吸附于QCM金表面。传感器集成于可容纳多达12个QCM传感器的电子鼻平台中，该平台配备温度湿度传感器（SHT31）、基于FPGA的信号处理电路、微型隔膜泵及聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）微通道歧管。
5. 5.
   数据多元统计分析：应用Kruskal-Wallis秩和检验评估差异，采用主成分分析（PCA）和线性判别分析（LDA）进行数据探索与分类，LDA分类器通过k折交叉验证优化。

研究结果

3.1 计算机模拟突变与对接筛选：对RferOBP1768和RferOBP23的结合口袋进行了表征。RferOBP1768的111个残基中有33个构成初级结合口袋，其中78.8%为疏水性；RferOBP23的122个残基中有17个构成初级结合口袋，其中76.4%为疏水性。热力学稳定性分析在RferOBP1768中鉴定出21个潜在稳定突变，在RferOBP23中鉴定出2个。虚拟对接筛选发现，对于RferOBP1768，6个突变蛋白对选定配体的预测结合亲和力高于WT；对于RferOBP23，1个突变体表现出更高亲和力。

3.2 蛋白表达与表征：基于对接筛选结果，选择了两个OBP突变体——RferOBP1768_Q12V和RferOBP23_R49L——及相应WT蛋白进行表达和纯化。

3.3 理论与实验结合数据比较：实验确定的结合常数证实，除ferrugineone外，WT RferOBP1768对所有测试配体的结合亲和力优于其他蛋白。结构分析表明，RferOBP1768的结合口袋表面积和深度约为RferOBP23的3倍，入口更宽，使配体可更深地进入口袋。突变体OBP的结合亲和力普遍低于WT，但结合常数的排序与计算预测一致，验证了计算机筛选策略的有效性。约0.55 mg RferOR1在Brij-58去垢剂中生产，成功整合入两种尺寸纳米盘，动态光散射（DLS）确认样品均匀，多分散指数（PDI）在0.1至0.2之间。

3.4 生物传感器制备：所有功能化传感器对气相分析物暴露均有灵敏响应。RferOR1传感器的响应幅度取决于纳米盘尺寸，突变体OBP的响应幅度持续高于对应WT蛋白。

3.5 传感器表征：传感器响应可逆，信号可恢复至基线。尽管乙酸乙酯的饱和蒸气压比ferrugineol高约1330倍，传感器对RPW信息素的响应比对乙酸乙酯高4-6倍，证明了选择性。经蒸气压归一化后，所有传感器对ferrugineol表现出显著亲和力，而对次要信息素组分ferrugineone的亲和力普遍较低。突变体OBP对ferrugineone的归一化亲和力显著高于对应WT蛋白，证明靶向突变可改变配体选择性。

3.6 传感器阵列性能与分析物区分：单个传感器无法可靠区分信息素与结构相似的植物酯类。通过穷举所有63种阵列组合并训练LDA分类器，确定了实现100%分类精度的最小阵列由三个传感器组成：RferOBP23_R49L、RferOBP1768_Q12V和小尺寸纳米盘中的OR1₁。PCA显示，第一主成分解释了96%的总方差，ferrugineol形成与其他分析物良好分离的聚类。

3.7 气相ferrugineol检出限测定：估算ferrugineol的检出限（LOD）约为60 ppb，ferrugineone的LOD约为370 ppb。

3.8 活体昆虫实验室验证：传感器对雄性R. ferrugineus的响应持续且显著高于雌性或椰蛀犀金龟（Oryctes rhinoceros）。PCA证实可明确区分雄性R. ferrugineus与其他昆虫。

3.9 棕榈树田间验证：田间试验在沙特阿拉伯利雅得的实验海枣园进行。传感器对被侵染棕榈树的响应与对田间采集的R. ferrugineus成虫的响应幅度相似，且均显著高于未侵染树。PCA显示被侵染与未侵染棕榈树之间存在清晰且统计稳健的分离，表明检测到的信号主要来源于驻留象甲释放的聚集信息素。

3.10 生物传感器运行稳定性：OBP功能化传感器在12个月监测期内保持完全活性；RferOR1 QCM传感器在连续220天（约7个月）监测期内保持完全功能并产生可重复响应。

讨论与结论

该研究成功开发了一种基于昆虫嗅觉机制的生物杂合传感器阵列，通过将红棕象甲的两种OBPs及其突变体与嵌入纳米盘的RferOR1整合到QCM平台上，实现了对主要信息素组分ferrugineol的高灵敏度（60 ppb）和高选择性气相检测。研究结论指出，该传感器阵列能够在实验室条件下区分雄性R. ferrugineus、雌性R. ferrugineus及共栖非靶标昆虫，并在真实田间环境中可靠区分被侵染与未被侵染的棕榈树。此外，OBP和OR功能化传感器分别在12个月和7个月的常温储存条件下保持了完整的操作功能，展示了卓越的长期稳定性。该便携式仿生检测平台为红棕象甲侵染的早期检测与实时监测提供了一种实用且可持续的工具，对综合虫害管理项目具有直接的应用价值。