粪便sIgA与多标志物模型鉴别早产儿确诊坏死性小肠结肠炎（NEC）：ClosNEC多中心队列辅助分析

《Pediatric Research》：Stool biomarkers discriminate confirmed necrotizing enterocolitis in preterm infants

　　

背景：坏死性小肠结肠炎（NEC）是早产儿发病和死亡的主要原因。由于临床征象缺乏特异性，早期诊断仍具挑战性。研究人员评估了粪便生物标志物能否区分确诊NEC的早产儿与无NEC早产儿。方法：研究人员在多中心ClosNEC队列中开展辅助分析，纳入胎龄<32周的婴儿。对确诊NEC（改良Bell II期或以上）的婴儿在诊断时采集粪便样本，并在出生后日龄相近的无NEC早产儿中采集样本。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒定量粪便钙卫蛋白（fCal）、人β-防御素-2（hBD-2）、α₁-抗胰蛋白酶（α₁-AT）、分泌型免疫球蛋白A（sIgA）、扣带蛋白（cingulin, CGN）和嗜酸性粒细胞衍生神经毒素（EDN）。采用受试者工作特征（ROC）分析和logistic回归评估判别性能。结果：分析纳入130例早产儿：42例确诊NEC，88例无NEC。除CGN外，各组间所有标志物浓度均有差异。sIgA的个体判别性能最佳（AUC=0.82），其次为fCal（AUC=0.74）和α₁-AT（AUC=0.73）。四标志物模型AUC=0.83，六标志物完整病例模型AUC=0.86。结论：粪便生物标志物可区分确诊NEC婴儿与无NEC婴儿。研究人员的发现支持在因疑似NEC接受评估的婴儿中开展前瞻性验证，包括临床相关对照人群。意义：粪便生物标志物在多中心队列中区分了确诊NEC婴儿与无NEC婴儿。sIgA显示最强的个体判别性能，AUC为0.82。六标志物完整病例模型在108例婴儿中AUC为0.86。这些标志物是进一步评估作为NEC评估无创工具的潜在候选。需要在疑似NEC及存在竞争性新生儿诊断的婴儿中进行验证。

研究背景：早产仍是全球新生儿发病和死亡的重要原因。坏死性小肠结肠炎（NEC，以肠道炎症和坏死为特征的早产儿严重胃肠道急症）是新生儿重症监护病房（NICU）中最具破坏性的急症之一，尤其见于极早产和极低出生体重婴儿。NEC约影响2%～7%的NICU早产儿，并与显著死亡相关，需手术者尤甚。NEC早期识别困难，因为初始临床表现缺乏特异性，且与脓毒症、自发性肠穿孔等新生儿疾病重叠；诊断常在影像学或手术确认后建立，此时肠损伤可能已进展。当前NEC管理以支持治疗为主，包括禁食、抗生素及有指征时手术；预防策略包括人乳喂养及根据本地实践和证据基础补充益生菌。早产是NEC主要危险因素，反映肠上皮、黏膜免疫系统和微生物生态系统的发育不成熟；黏液产生减少、抗菌防御减弱、sIgA反应受限及微生物群不稳定导致屏障功能受损和炎症信号放大，肠通透性增加可促进肠腔微生物产物易位并放大黏膜损伤。常用血、尿标志物如C反应蛋白和降钙素原反映全身炎症，但对肠损伤缺乏特异性，对NEC判别价值有限，因此粪便标志物受到关注，因其可无创反映肠道炎症、上皮屏障功能障碍和黏膜免疫活动，更接近病变部位。然而既往研究多聚焦单一标志物、单中心或小队列中有限分析物。在此背景下，研究人员在多中心ClosNEC队列中开展辅助分析，评估反映NEC生物学互补领域的六种粪便标志物，包括肠道炎症、上皮屏障功能障碍、抗菌防御和黏膜免疫，比较确诊NEC婴儿与无NEC早产儿的标志物浓度，并评估单个及组合标志物在诊断时的判别性能；假设多标志物粪便谱较单个标志物提供更强判别。研究结论为粪便生物标志物可区分确诊NEC与无NEC早产儿，sIgA个体判别最佳，多标志物模型仅适度增量改善；其意义在于支持这些标志物作为NEC评估的无创候选工具，并需在疑似NEC及临床相关对照人群中前瞻性验证。关键技术方法（不超过250字）：该研究为多中心ClosNEC队列（ClinicalTrials.gov标识NCT02444624）内嵌套的辅助生物标志物分析，样本来自法国20个NICU、16个月期间胎龄<32周早产儿；确诊NEC依据改良Bell II期或以上，对照为住院期间无临床或影像学NEC且有粪便样本的早产儿，并排除自发性肠穿孔。粪便按统一程序采集、稀释、冻存于?80°C；采用ELISA定量fCal、hBD-2、α₁-AT、sIgA、CGN和EDN。统计分析使用R 4.4.1，连续变量以中位数和四分位距（IQR）表示，采用Wilcoxon秩和检验和Fisher精确检验；以ROC分析、logistic回归、bootstrap重采样（2000次）估计AUC及95%置信区间，必要时以Youden指数估计阈值、敏感度和特异度，并以Spearman相关分析标志物间关联；缺失标志物数据未插补。

研究结果：一、研究人群。142份收集粪便样本中130份有足够材料完成至少一项标志物分析并纳入，其中42份来自确诊NEC婴儿、88份来自无NEC早产儿；12份因粪便材料不可用或不足被排除。两组基线特征总体相似，但人乳暴露不同。两组中位胎龄均为28周（p>0.9），NEC组中位出生体重983 g，无NEC组973 g（p=0.7）；剖宫产分别为62%和59%（p=0.8）；采样时中位出生后日龄分别为24天和28天（p=0.6）；均未接受益生菌。NEC组第3天纯人乳喂养较无NEC组少（p=0.005），第7天无差异（p=0.5）；第3天纯供体人乳喂养在无NEC组更常见（p=0.01），人乳与婴儿配方混合喂养在NEC组更常见（p=0.004）。二、确诊NEC婴儿与无NEC早产儿的粪便生物标志物浓度。除CGN外，各组间所有标志物浓度均有差异。与无NEC早产儿相比，NEC婴儿fCal、EDN和α₁-AT浓度较高，hBD-2和sIgA浓度较低。fCal中位数198 vs 77 μg/g（p<0.0001），EDN 597 vs 325 ng/g（p=0.002），α₁-AT 248 vs 105 μg/g（p<0.0001）；hBD-2为9 vs 27 ng/g（p=0.007），sIgA为89 vs 2211 μg/g（p<0.0001）；CGN两组均为0.46 ng/g（p=0.8）。因人乳暴露组间不同且母源IgA可能贡献婴儿粪便sIgA，研究人员按第3天和第7天奶类分析sIgA：第3天纯供体人乳、纯母亲自己母乳和混合喂养者中位sIgA分别为1592、958和320 μg/g，总体差异显著（p=0.02），纯供体人乳和纯母亲自己母乳均高于混合喂养（均p=0.02），纯供体人乳与纯母亲自己母乳间无差异（p=0.7）；第7天按奶类无显著差异（p>0.3）。调整奶类后，NEC组sIgA在第3天和第7天仍显著低于无NEC组（均p<0.001）；按人乳暴露分层，第3天NEC组sIgA在未接受人乳者（p=0.0008）和接受人乳者（p=4.7×10^?6）中均较低。探索性调整分析在130例非fCal标志物完整数据婴儿中进行，调整胎龄、分娩方式和人乳暴露后，低hBD-2、低sIgA、高EDN和高α₁-AT与NEC的关联仍显著。三、个体生物标志物的判别性能。sIgA个体判别最佳（AUC=0.82），其次fCal（AUC=0.74）和α₁-AT（AUC=0.73）；EDN判别中等（AUC=0.67），CGN无信息价值（AUC=0.51）。由于低hBD-2和低sIgA浓度与NEC相关，这两种标志物的ROC分析方向设定为较低值预测病例状态。四、标志物两两相关分析。在六种标志物均有数据的子集（40例NEC和68例无NEC早产儿）中，标志物关系在组间不同。无NEC早产儿中相关一般弱至中等，最强为EDN与α₁-AT（r=0.43），sIgA与α₁-AT（r=?0.14）及sIgA与hBD-2（r=?0.17）呈弱负相关。NEC婴儿中相关更一致为正向且幅度更大，尤其EDN与α₁-AT（r=0.64）、EDN与fCal（r=0.54）、hBD-2与CGN（r=0.49）。总体相关弱至中等，NEC婴儿中似乎更强，提示炎症、屏障和黏膜免疫标志物存在部分生物学重叠但非完全冗余。五、多标志物模型。四标志物模型包括α₁-AT、EDN、hBD-2和sIgA，在全部130例婴儿中拟合，未纳入fCal（仅108例可测）和CGN（无个体判别价值），探索性模型AUC=0.83，数值上高于多数单个标志物，但较sIgA单独判别增益有限。六标志物logistic回归模型包括fCal、hBD-2、α₁-AT、sIgA、CGN和EDN，在108例六种标志物均有数据的婴儿中作为完整病例分析拟合，AUC=0.86；其余22例仅因剩余粪便材料不足无法测fCal而被排除于该模型。由于六标志物模型在缩减的完整病例样本中评估，其AUC不应解释为较全队列sIgA的AUC直接提升；总体上组合标志物的增量增益有限。

讨论部分总结：研究人员认为，该辅助分析显示反映肠道炎症、上皮屏障功能障碍和黏膜免疫的粪便标志物在确诊NEC婴儿与无NEC早产儿间存在差异，sIgA个体判别最佳，多标志物模型仅适度增量改善，支持粪便标志物作为NEC评估的生物学合理候选。机制上，fCal和EDN升高支持先天免疫激活增强，包括中性粒细胞和嗜酸性粒细胞相关炎症反应；α₁-AT升高与肠屏障破坏和肠腔蛋白丢失相符；NEC婴儿hBD-2较低可能反映肠上皮抗菌反应受损或肠损伤时上皮激活改变；sIgA显著降低与黏膜免疫保护减弱和肠腔微生物暴露控制减少相符；这些过程可能相互关联而非独立，黏膜免疫排除减少可促进微生物过度刺激，上皮屏障破坏可促进细菌产物易位和炎症损伤放大；相关分析显示标志物间多为弱至中等关联，NEC婴儿中协调性更强，提示部分生物学重叠但非完全冗余，也可能解释多标志物组合仅较最佳单个标志物适度改善而非大幅提升。sIgA与NEC的负向关联尤其值得注意，但需谨慎解释，因为组间人乳暴露不同且母源IgA贡献婴儿粪便sIgA；分层分析中接受和不接受人乳的NEC婴儿sIgA均较低，提示喂养差异不能完全解释该关联，但不能排除人乳暴露时机、持续时间或数量的残余混杂。CGN虽参与紧密连接组织，但本队列中粪便浓度在组间无差异，可能提示其肠腔释放有限、粪便CGN不稳定或对NEC相关肠损伤不够敏感。与既往多聚焦单个分析物、单中心、分析物较少或混合不同生物学 compartment 的研究相比，本研究在多中心早产儿队列中评估六种粪便标志物，覆盖炎症、屏障功能障碍和黏膜免疫等互补领域，属病理生理学结构化的方法拓展，但仍需独立且临床相关人群外部验证。临床上，粪便标志物因无创且可能比全身炎症标志物更接近肠道病理而有吸引力，但本研究评估的是确诊NEC与无NEC早产儿的判别，临床相关预期使用人群是疑似NEC、尚未影像学确认、需与脓毒症、喂养不耐受、自发性肠穿孔及其他临床恶化原因鉴别的婴儿，因此当前发现应视为假设生成，需在该预期使用人群及临床相关对照人群中前瞻性验证；临床实施还需与紧急床旁决策兼容的快速检测，目前粪便标志物应视为辅助工具而非独立诊断，床旁技术和自动免疫分析可能促进未来整合，但临床效用必须前瞻性证明。局限包括：确诊NEC与无NEC早产儿比较不能完全复现疑似NEC婴儿真实诊断决策，也不能建立早期预测性能；虽为多中心，样本量限制多变量模型复杂度，六标志物模型限于完整病例；早期人乳暴露组间不同可能影响粪便sIgA，虽有分层和调整分析支持低sIgA与NEC关联，但不能排除剂量、累积持续时间和精确时机的残余混杂；多标志物 panel 较sIgA单独仅适度改善，临床使用前需外部验证；危重早产儿粪便可得性可能有限，疑似NEC时粪便排出可能减少，可能限制粪便诊断在急性场景的适用性，未来应评估优化粪便采集策略和替代样本类型。结论翻译：粪便生物标志物在多中心队列中可区分确诊NEC婴儿与无NEC早产儿。sIgA显示最佳的个体判别性能，多标志物模型仅提供适度的增量改善。需要在因疑似NEC接受评估的婴儿中开展前瞻性外部验证，并纳入包括竞争性新生儿诊断的临床相关对照人群。