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自维持发光（self-sustained luminescence）能够实现全生物体水平的分子事件无创监测，但其强度同时取决于基因表达和细胞代谢，限制了定量解释。研究人员提出一种解耦基因表达与代谢贡献的方法。通过共表达经工程改造的参照荧光素酶变体（refere
自维持发光（self-sustained luminescence）能够实现全生物体水平的分子事件无创监测，但其强度同时取决于基因表达和细胞代谢，限制了定量解释。研究人员提出一种解耦基因表达与代谢贡献的方法。通过共表达经工程改造的参照荧光素酶变体（reference luciferase variant；使用相同底物但发射不同波长光）并监测颜色比值（colour ratio），研究人员显著降低了信号变异性，从而在代谢活性变化条件下实现定量生理成像（quantitative physiological imaging）。
该研究围绕自发光（autoluminescence；由细胞内生物合成底物驱动的发光）报告系统的定量化问题展开。发光成像因背景低、信噪比高和动态范围宽而常用于基因表达测量；但在全生物体尺度上，依赖外源萤光素（luciferin；发光底物）的成像存在侵入性、成本高、摄取差、底物分布不均及潜在毒性等问题。通过细胞内合成底物实现自发光已有细菌脂肪酸代谢分支和真菌苯丙烷代谢分支两条异源途径，其中真菌途径易整合到植物和真菌代谢。然而，所有自维持发光技术均固有地非定量：萤光素在细胞中生物合成，发光不仅反映生物发光基因表达，也反映代谢活性，包括前体生产与摄取、还原当量和能量供应，并受温度、氧可用性等环境因素影响，干扰定量成像。因此，研究人员旨在工程化自发光系统，使基因表达报告独立于代谢；策略是共表达使用同一底物但发射不同颜色光的两种荧光素酶（luciferase；催化发光反应的酶），以颜色比值反映二者相对丰度并降低对底物浓度的依赖。该研究发表在《Nature Plants》。
关键技术方法：设计双色比率型自发光报告；筛选真菌荧光素酶内部插入/缺失文库，并以BRET（生物发光共振能量转移；荧光素酶与荧光蛋白间能量转移）工程化红移变体Luz593、Luz608、Luz640；在N. tabacum BY-2细胞包、野生型N. benthamiana叶片和转基因A. thaliana中验证，样本包括BY-2培养、野生型N. benthamiana、Columbia 0拟南芥及前期Michael Karampelias建立的luciferase-less master line AT9865（T1植株）；用消费级相机和IVIS成像，RT–qPCR（逆转录定量PCR；转录检测）验证，cycloheximide chase测半衰期并行统计检验。
研究结果小标题：双色报告系统的设计与红移真菌荧光素酶的工程化。研究人员将绿色和红色荧光素酶置于不同调控元件下设计双色报告：红色参照由组成型启动子驱动，绿色报告由可变启动子驱动；同底物不同波长使颜色比值可定量启动子活性，并较大程度独立于底物浓度。为获得红移真菌荧光素酶，研究人员利用BRET策略，对nnLuz_v4进行全基因滑动插入17氨基酸柔性环及2氨基酸缺失文库筛选，在植物细胞中鉴定耐受结构扰动位点，包括蛋白末端及内部E119、I161-L167、Y188、V221和G260等；插入红荧光蛋白并优化连接肽、替换为nnLuz_v5、在末端附加荧光蛋白，获得Luz593、Luz608和Luz640。在N. tabacum BY-2细胞和Petunia hybrida花瓣中，普通消费级相机无滤光片即可检测颜色变化；Luz640光谱分离最大，但Luz593和Luz608亮度更高，故选后续实验；cycloheximide chase显示彩色变体稳定性与Luz533无差异，半衰期约9–10 h。结论是成功建立可用的双色自发光报告和红移真菌荧光素酶工具。
研究结果小标题：比率型自发光的代谢稳健性。通过TDZ（thidiazuron；合成植物生长调节剂）扰动植物激素稳态和代谢，在植物细胞培养和N. benthamiana叶片中共表达p35S驱动的Luz533与Luz608，比率读数较强度测量显著稳定；为减少红色参照干扰，瞬转中红色荧光素酶用量较绿色低3–10倍。细菌通路中克隆蓝光LuxA5的颜色偏移变体（绿色GNLX、黄色YNLX、红色RNLX），在BY-2细胞中比率读数比强度测量最高稳定16倍。用生理相关启动子时，pTCSv2（细胞分裂素敏感）驱动绿色Luz533、p35S驱动红色Luz593；绿色通道达峰后下降近十倍而比率大体稳定，TDZ处理呈剂量依赖，且与荧光比率EGFP/mScarlet-I3ΔC10报告相似；N. benthamiana中Luz608作红色参照，qPCR确认比率变化与基因表达变化相关，RT–qPCR在低浓度下更敏感。转基因A. thaliana中用pWRKY70或pORCA3驱动Luz533，pMinSyn108驱动Luz593；pWRKY70报告株三天成像中强度波动但比率在无乙酰水杨酸诱导刺激时稳定；观察到莲座叶免疫活动闪烁；乙酰水杨酸（ASA）诱导下发光与转录一致；pORCA3报告株感染P. savastanoi（Pseudomonas savastanoi；病原细菌）后比率稳定，在明亮叶脉背景中揭示感染部位局部响应。结论是比率型自发光在真菌和细菌通路、细胞培养和整株植物中降低信号变异，并可在代谢变化中监测激素响应启动子活性。
讨论与结论翻译：总体而言，该研究表明，通过共表达两种光谱不同、利用同一底物的荧光素酶，可将原始发光信号转换为对代谢波动稳健的比率读数。研究中，研究人员使用组成型合成启动子表达参照荧光素酶，并将构建体随机整合到基因组；该方法对参照启动子潜在的组织特异性和基因组位点效应敏感，因此建议用正交方法验证基于自发光报告系成像得出的结论。但在细胞培养和整株植物的真菌与细菌通路中，该方法显著降低信号变异，并允许在组织代谢变化中监测激素响应启动子活性。双色自发光构建为植物及其他生物分子生理定量成像提供直接途径。
