铜绿假单胞菌调控金黄色葡萄球菌生物膜形成与抗生素耐受性的种间互作及共感染致病性研究

《Scientific Reports》：Pseudomonas aeruginosa modulates Staphylococcus aureus biofilm formation and antibiotic resistance

　　

本研究探讨了细菌物种间共存如何影响彼此的毒力和抗菌药物耐药性。研究人员利用12个细菌组合在体外评估了与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P. aeruginosa）共培养对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）在亚最低抑菌浓度（sub-MIC）抗生素暴露下毒力和存活的影响。这些组合分为三组：标准组合、同患者共分离组合和随机组合。研究人员还使用小鼠模型评价了这些相互作用对致病性的影响。共培养显著增强了S. aureus在暴露于阿奇霉素（100%）、庆大霉素（91.7%）、头孢吡肟（91.7%）和环丙沙星（58.3%）后的存活。同样，生物膜（biofilm）形成和凝块溶解活性分别在83%和67%的混合物中显著增强。基因表达分析显示，与单培养相比，icaD和sspA分别在100%和89%的受试组合中显著上调。总体而言，结果证明两种病原体之间的种间互作提高了S. aureus的抗菌药物耐受性和毒力。与这些发现一致，共感染小鼠表现出更高的死亡率和肺、肝组织中升高的细菌计数。综上，这些发现突出多微生物互作在评价细菌致病性和抗菌药物耐药性中的作用。

研究背景与意义：S. aureus（金黄色葡萄球菌）和P. aeruginosa（铜绿假单胞菌）是手术部位感染、肺部感染、慢性伤口、坏死性筋膜炎和糖尿病足溃疡等感染中常见的共同分离病原体。传统上P. aeruginosa被报道可在混合感染中竞争抑制S. aureus，但近期研究报道二者可在同一感染部位共存并互作，且常与毒力增强和/或抗菌药物耐药相关。单感染通常可用传统广谱抗生素治疗，而多微生物感染治疗困难且常与较差临床结局相关；S. aureus与P. aeruginosa双定植使治疗策略复杂化，因为每种病原体可能需要不同治疗途径。二者共存复杂性究竟源于各自毒力策略还是互惠获益仍不清楚，传统抗生素治疗可能因共存而效果下降。因此，研究人员评估P. aeruginosa对S. aureus在多种抗生素亚最低抑菌浓度（sub-MIC）暴露下存活及毒力因子产生的影响，并用小鼠模型评价相互作用的致病性。研究构建12个S. aureus/P. aeruginosa组合，含标准、同患者共分离和随机组合；体外评估共培养对S. aureus亚MIC抗生素存活、生物膜形成、凝块溶解活性及icaD、sspA表达的影响；体内用BALB/c小鼠比较单感染、序贯感染和同时共感染的死亡率及肺肝细菌载量。结果显示共培养提高S. aureus对阿奇霉素、庆大霉素、头孢吡肟和环丙沙星暴露后的存活，增强生物膜形成和凝块溶解活性，上调icaD和sspA，共感染小鼠死亡率更高且肺肝细菌载量升高。该研究提示多微生物互作可增强S. aureus抗菌药物耐受和毒力，评价细菌致病性和耐药性时需考虑种间互作。

关键技术方法概述：临床菌株来源为Mansoura市不同医院和诊所的伤口、痰液、脓液和糖尿病足样本，共50株临床分离株，患者年龄30–55岁；另纳入S. aureus参考株Newman和P. aeruginosa参考株PAO1。研究设计12个S. aureus/P. aeruginosa组合，分为标准、同患者共分离和随机组。关键技术包括P. aeruginosa无细胞上清与S. aureus的生长表型试验、亚MIC抗生素存活及倍数变化（FC）分析、结晶紫微孔板生物膜试验、粗培养上清凝块溶解试验、PCR检测icaD、sspA和nuc、以nuc为内参的实时定量PCR（qRT-PCR）并用2^?ΔΔCt法计算相对表达，以及BALB/c小鼠（6–8周龄，19–20 g）鼻内感染模型，设单感染、P–S、S–P、S+P和未感染对照，观察7天存活并计数肺、肝组织菌落形成单位（CFU）。研究经Mansoura大学药学院伦理委员会批准（2025-188），动物方案经MU-ACUC批准（PHARM.PHD.24.05.41）。

研究结果：
1. 混合物设计与生长表型鉴定（Mixtures design and growth phenotype identification）：从不同临床来源分离25株S. aureus和25株P. aeruginosa，分别编号S1–S25和P1–P25；依据药敏结果选择最耐药和最敏感菌株设计12个组合。结论是建立了用于评价种间互作的标准、同患者共分离和随机组合体系。
2. P. aeruginosa上清的生长表型（Growth phenotype using P. aeruginosa supernatant）：在静态琼脂扩散试验中，含P. aeruginosa无细胞滤液的孔周围对相应S. aureus未见抑制圈。结论是在该实验条件下未检出可检测的生长抑制活性，但作者强调这不等同于共存的确证证据。
3. 共培养对S. aureus抗生素敏感性的影响（The impact of co-culture on S. aureus antibiotic sensitivity）：与相应单培养相比，共培养使S. aureus在亚MIC阿奇霉素（100%组合）、庆大霉素（91.7%）、头孢吡肟（91.7%）和环丙沙星（58.3%）暴露后存活增强；S11/P11与头孢吡肟组合的FC最高，为11×10⁵倍，S12/P12与阿奇霉素组合为25×10⁴倍。结论是P. aeruginosa共培养提高S. aureus的抗生素耐受性。
4. P. aeruginosa无细胞上清影响S. aureus生物膜形成（Pseudomonas aeruginosa cell-free supernatant affects biofilm formation in S. aureus）：通过结晶紫染色评估浮游上清对聚苯乙烯板静态生物膜的影响，83%的组合生物膜形成显著增加（p<0.0001）；Newman/PAO1和Sr5/PAO1分别增加200%和187.6%。结论是P. aeruginosa上清可增强S. aureus生物膜生物量。
5. 与P. aeruginosa共培养对S. aureus凝块溶解活性的影响（The effect of co-culture with P. aeruginosa on S. aureus clot lysis activity）：8/12个组合（67%，p<0.0001）的凝块溶解活性显著增加，Sr5/PAO1最高增加206%。结论是共培养增强S. aureus凝块溶解相关毒力表型。
6. 毒力基因分子检测（Molecular detection of virulence genes）：PCR显示91.7%的分离株携带icaD，75%携带sspA。结论是所试S. aureus中两类毒力相关基因携带较普遍。
7. RT-PCR分析（RT-PCR analysis）：以nuc为内参，采用2^?ΔΔCt法计算相对表达；icaD在所有混合物中上调（p=0.004），Newman/Ps3、Newman/PAO1和Ss2/PAO1分别上调99.6、98和97倍；sspA在携带该基因的9个共培养中8个（89%，p=0.02）上调，Newman/PAO1最高上调69.8倍，Sr7/Ps5是唯一显著下降的混合物。结论是共培养可在转录水平上调S. aureus毒力相关基因。
8. 体内试验（In vivo assay）：非致死剂量确定中，10⁹ CFU在24 h内致100%小鼠死亡，10⁷ CFU引起严重症状并在48 h后死亡，10⁵ CFU引起肺炎样症状，最终选择10³ CFU用于后续试验。结论是确定后续感染模型剂量。
9. P. aeruginosa PAO1共感染增加S. aureus Newman感染小鼠的发病和死亡（Co-infection with P. aeruginosa PAO1 strain increased morbidity and mortality in S. aureus Newman-infected mice）：同时共感染S+P组5只中4只（80%）在感染2天内死亡；S–P和P–S组总死亡率均为60%，但S–P组死亡更早，P–S组第3天才首次记录死亡；S、P和NI组无死亡。第7天存活小鼠中，共感染增加肺内S. aureus Newman载量，P–S和S–P组肝内S. aureus Newman计数高于S组。结论是共感染增加死亡和细菌定植，但作者指出载量仅在存活至第7天的小鼠中测定，存在生存者选择偏倚。

讨论与结论：讨论指出，无细胞滤液试验无抑制圈只能说明在该实验条件下未检出抑制，不能作为共存的决定性证据；P. aeruginosa与S. aureus相互作用高度依赖环境，营养条件、细菌生长状态和群落组织可改变种间行为。研究结果与既往关于多物种存在影响抗生素敏感性的报道一致，共培养提高S. aureus对阿奇霉素、庆大霉素、头孢吡肟和环丙沙星的存活。生物膜试验仅用结晶紫染色和光密度（OD）测定总生物量，不能区分活细胞与非活细胞或表征胞外基质，因此生物膜结果需结合该局限解释。凝块溶解、icaD和sspA表达结果提示种间互作可在表型和转录水平调节S. aureus毒力。体内同时共感染死亡率最高，S. aureus先感染再P. aeruginosa可加速死亡，但第7天肺载量最高见于S–P组；由于死亡前未测载量，终点载量不能直接解释死亡率，死亡还可能反映急性宿主反应、组织损伤等。Newman和PAO1为标准化参考株，可能不能完全代表临床共分离株。研究结果与Antonic等关于P. aeruginosa诱导S. aureus转录变化并促进其毒力和胞内生存的报道一致；与Cigana等观察到S. aureus先感染再暴露于P. aeruginosa的小鼠死亡率低于单P. aeruginosa感染的报道不同，提示二者可在肺内同时存在而无明显拮抗。

研究结论翻译：本研究表明S. aureus与P. aeruginosa之间的互作显著影响S. aureus的表型和分子特征。与P. aeruginosa共培养增强了S. aureus耐受不同类别抗生素的能力，包括头孢吡肟、庆大霉素、环丙沙星和阿奇霉素。此外，S. aureus分离株表现出生物膜形成和凝块溶解活性增加。这些表型变化伴随毒力相关基因icaD和sspA表达升高，表明种间互作可在转录水平调节S. aureus的致病性状。与体外发现一致，小鼠共感染实验显示更高致病性，表现为小鼠死亡增加以及肺和肝组织中S. aureus计数升高。总体而言，这些发现提示P. aeruginosa的存在可增强S. aureus的毒力和抗菌药物耐受性，强调在感染性疾病管理和治疗中考虑多微生物互作的重要性。