实验性肺动脉高压大鼠模型细胞外囊泡货物特征：线粒体组分与翻译后修饰蛋白

《Antioxidants》：Characterization of Extracellular Vesicle Cargo in the Experimental Rat Model of Pulmonary Hypertension Mitochondrial Components and Post-Translationally Modified Proteins

　　

英文摘要翻译：细胞释放的细胞外囊泡（EVs）携带多种分子货物，包括蛋白质、脂质、核酸和线粒体。此外，EVs还携带抗氧化剂以及产自由基酶，如NADPH氧化酶或其他氧化酶。越来越多的证据表明，EV货物在细胞间通讯和疾病发病机制中发挥关键作用。在肺动脉高压（PH）中，循环EV水平升高；然而，EVs是否传递线粒体及其蛋白质货物组成仍知之甚少。为弥补这一知识空白，研究人员在Sugen5416（SU；20 mg/kg，皮下注射）和低氧（10% O?）诱导的PH大鼠模型中表征了EVs的货物特征。研究人员从SU/低氧（SU/Hx）和SU/常氧（SU/Nx）大鼠左心室采集的血液中分离EVs，并使用基于定量质谱的蛋白质组学和流式细胞术进行分析。蛋白质组学分析显示，EVs含有参与凝血、补体、免疫信号传导、代谢、受体信号传导和细胞骨架组织的蛋白质。来自SU/Hx大鼠的EVs含有特定蛋白质，这些蛋白质参与细胞骨架结构、代谢、免疫信号传导和细胞黏附，且被优先富集并携带翻译后修饰。这些分子变化可能与潜在的PH进展相关。重要的是，来自SU/Hx大鼠的EVs含有显著更高丰度的线粒体蛋白组分（通过质谱检测到），且线粒体膜电位更为超极化（通过MitoTracker Red与MitoTracker Green信号比值确定），同时线粒体超氧阴离子水平较低（通过MitoSOX荧光确定）。综上，这些发现首次证明了实验性PH模型中循环EV富集制剂中存在线粒体内容和蛋白质货物。

论文解读：实验性肺动脉高压大鼠模型细胞外囊泡货物特征——线粒体组分与翻译后修饰蛋白

1. 研究背景与科学问题

肺动脉高压（pulmonary hypertension, PH）是一种以肺血管重构、肺血管阻力进行性升高和右心衰竭为特征的复杂多因素疾病。细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是介导细胞间通讯的重要载体，可携带蛋白质、脂质、核酸乃至线粒体等生物活性分子，并通过传递这些分子调控受体细胞的功能。已有研究表明，PH患者及实验动物模型中循环EV水平升高，EVs可传递DNA甲基转移酶、炎症相关分子等，促进肺血管内皮炎症和血管重构。然而，既往研究对PH状态下EVs是否携带线粒体内容物，以及其蛋白质货物（尤其是翻译后修饰蛋白）的组成仍缺乏系统认识。因此，研究人员开展本研究，旨在通过无偏倚的定量蛋白质组学和流式细胞术，系统表征实验性PH大鼠模型循环EVs的蛋白质货物和线粒体组分，以阐明EVs在PH病理机制中的潜在作用。

2. 研究设计与技术方法

研究人员选用Sugen5416联合低氧（SU/Hx）诱导的PH大鼠模型，以SU/常氧（SU/Nx）大鼠作为对照。年龄和体重匹配的Sprague-Dawley（SD）大鼠（每组n=5）随机分组，SU/Hx组接受皮下注射Sugen5416（20 mg/kg）后置于10% O?低氧环境3周，再于常氧环境恢复5周；SU/Nx组于常氧环境维持8周。实验结束后采集左心室血液，分离血浆EVs（部分样本采用超速离心法验证）。主要技术方法包括：基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的定量蛋白质组学分析（采用Evosep One系统耦合timsTOF Pro质谱仪，FragPipe/MSFragger进行数据库搜索和定量）；流式细胞术分析EV表面标志物CD63、线粒体膜电位（MitoTracker Red/MitoTracker Green比值）及线粒体超氧阴离子水平（MitoSOX荧光）；PANTHER通路富集分析等生物信息学方法。

3. 主要研究结果

3.1 SU/Hx增加血液中CD63+ EV的比例

超声心动图确认SU/Hx显著降低肺动脉加速时间与射血时间比值（PAAT/ET），并引起室间隔厚度增加等心脏重构改变，证实PH模型建立成功。流式细胞术检测显示，SU/Hx大鼠左心室血液中CD63+ EV比例较SU/Nx组显著升高，提示PH状态下循环EV水平增加。

3.2 EVs蛋白质货物特征与通路富集

无偏倚蛋白质组学分析显示，SU/Hx与SU/Nx组EV蛋白丰度存在明显差异。PANTHER通路富集分析鉴定出144条相关通路，主要包括Rho GTPase细胞骨架调控、钙黏蛋白信号、FGF信号、烟碱型乙酰胆碱受体信号、趋化因子/细胞因子介导的炎症、整合素信号、泛素-蛋白酶体过程和糖酵解等。这些发现表明SU/Hx深刻改变了EV蛋白质货物所涉及的结构、代谢和信号通路。

3.3 差异表达蛋白及其生物学功能

两组间EV总蛋白含量无显著差异，但SU/Hx组EV中多种蛋白丰度发生改变。升高的蛋白包括：细胞质动力蛋白1重链1（细胞骨架运动蛋白）、吸引素（炎症和能量稳态相关）、长链脂肪酸-CoA连接酶1（脂肪酸代谢酶）、血管细胞黏附蛋白1（VCAM1）、免疫球蛋白γ-2A链C区、高迁移率族蛋白B1（HMGB1，促炎性损伤相关分子模式）、磷脂酰肌醇聚糖特异性磷脂酶D（GPI-PLD）、触珠蛋白和丝氨酸蛋白酶抑制剂A3N等。降低的蛋白包括多种细胞骨架和结构蛋白、低密度脂蛋白受体相关蛋白1、Rab-8A、补体C4、C4b结合蛋白α链等。这些结果提示PH状态重塑了EV蛋白质货物，选择性增强代谢、黏附、免疫和应激相关蛋白的包装。

3.4 EVs中翻译后修饰蛋白的鉴定

PTM特异性蛋白质组学分析检测到多种翻译后修饰，包括甲硫氨酸氧化（+15.9949 Da）、脯氨酸氧化（+15.9949 Da）、N端乙酰化（+42.0106 Da）、N端焦谷氨酸形成（?17.0265 Da）和半胱氨酸氨基甲酰甲基化（+57.0215 Da）。SU/Hx大鼠EV中氧化甲硫氨酸（比值2.7:1.0）和氧化脯氨酸（比值2.0:1.0）的修饰丰度较SU/Nx组增加，N端焦谷氨酸修饰比值也升高（3.0:1.0）。聚类分析显示，触珠蛋白（HPT）、免疫球蛋白γ-2A链C区（IGG2A）、VCAM1和胎球蛋白B（FETUB）等修饰蛋白在SU/Hx组显著富集，而肌动蛋白α-心肌型（ACTC）等则降低。

3.5 EVs中线粒体含量增加

蛋白质组学检测到EV中多种线粒体蛋白（如长链脂肪酸-CoA连接酶1、氨甲酰磷酸合酶、谷氨酸脱氢酶1和60 kDa热休克蛋白）在SU/Hx组显著富集。流式细胞术进一步显示，SU/Hx组EV的MitoTracker Red+/MitoTracker Green+比值升高，提示其中含有更多膜电位高度超极化的线粒体组分。然而，MitoSOX荧光信号在SU/Hx组反而降低，表明这些超极化线粒体并未伴随较高的线粒体超氧阴离子水平，可能反映EV内局部超氧产生减少或探针可及性改变。

4. 讨论与结论

研究人员在讨论中指出，PH是一种多系统疾病，EVs可能作为肺与非肺器官间通讯的整合介质。SU/Hx EVs携带的蛋白涵盖炎症、细胞黏附、血管平滑肌细胞表型转换、血管生成、凝血、心脏重构、固有免疫激活、细胞周期、凋亡、PAR和Rho/ROCK信号及代谢稳态等通路，支持EVs在PH全身性病理改变中的潜在作用。线粒体内容物的发现具有重要意义：由于线粒体起源于细菌（内共生理论），循环EV中的线粒体核酸可能激活cGAS-STING干扰素信号，促进炎症和免疫调节代谢物（如犬尿氨酸）合成，从而加剧PH相关全身氧化应激和组织损伤。值得注意的是，研究人员首次证明PH状态下循环EV富集制剂中存在线粒体组分，且其膜电位呈超极化状态。

研究结论：本研究证明，实验性PH大鼠模型血液中循环EV比例增加；无偏倚蛋白质组学揭示这些EVs携带可能参与免疫激活、炎症、凝血和心脏重构的蛋白质；此外，PH大鼠EVs含有更丰富的线粒体组分，且这些线粒体呈超极化状态。

研究局限性包括：未明确EV货物的生物学功能及具体细胞/组织来源；流式细胞术方法本身存在局限；EV纯度和异质性表征不完整；沉淀法可能共分离非EV成分；缺乏直接的EV转移实验；部分蛋白修饰可能产生于样品制备过程。这些局限性提示后续研究需进一步验证EV货物的功能意义及其在PH发病中的因果作用。