土人参（Talinum paniculatum）不同部位乙醇提取物的化学特征、抗氧化活性及基于代谢组学与QSAR的潜在细胞保护机制计算探索

《Antioxidants》：Chemical Profiling, Antioxidant Activity, and Computational Exploration of Potential Cytoprotective Mechanisms of Talinum paniculatum via Metabolomics and QSAR Approaches

　　

摘要专业翻译 土人参（Talinum paniculatum）表现出显著的抗氧化能力，然而其发挥该能力的具体生物活性代谢物及分子机制仍有待阐明。本研究制备了土人参地下部分（根，TP-ER）和地上部分（茎和叶，TP-ESL）的乙醇提取物，测定了总酚和总黄酮含量，进行了体外抗氧化实验，并评估了其对HepG2细胞中H2O2诱导氧化应激的细胞保护作用。在所有检测条件下，TP-ER均表现出高于TP-ESL的活性。随后，研究人员对两种提取物进行了广泛靶向代谢组学分析以注释其代谢物。利用基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）通过计算筛选与氧化损伤相关的基因。三个p53通路基因（CDKN1A、JUN和PMAIP1）被优先选为候选靶点进行进一步研究。研究人员利用ChEMBL报道的活性数据集构建了定量构效关系（Quantitative Structure–Activity Relationship，QSAR）模型，作为探索性合并分类器，以在合并的p53相关靶点数据集中优先筛选具有潜在活性的已注释代谢物。该分类器不针对单个靶点分配活性。三个已注释代谢物被预测为潜在活性物质，包括两个甾体和一种生物碱。分子对接将N-咖啡酰-4-O-甲基多巴胺和norflickinflimiod F分别优先确定为与增殖细胞核抗原（PCNA）/活化T细胞核因子1（NFAT1）及NOXA BH3界面具有良好预测结合能力的候选代谢物。这些发现为深入研究土人参的抗氧化和细胞保护作用提供了初步的化学基础，并产生了可检验的机制假说，有待未来研究进行实验验证。

论文解读

一、研究背景与研究目的

氧化应激被定义为人体内氧化系统与抗氧化系统之间稳态的破坏，会引发活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）的过度积累，进而损害正常组织结构和生理功能。在细胞水平上，氧化应激可诱导DNA损伤、蛋白质过度氧化和脂质过氧化，可能导致细胞衰老或凋亡，进一步加剧组织炎症并形成持续的恶性循环。氧化应激是多种慢性疾病（包括癌症、神经退行性疾病、心血管疾病和免疫功能紊乱）发生发展中的关键病理因素。越来越多的证据表明，膳食摄入天然抗氧化剂可有效抑制氧化应激，这些生物活性植物成分可清除自由基、调节关键细胞信号通路（包括PI3K、MAPK、TGF-β、NF-κB和Nrf2）并塑造表观遗传修饰，从而发挥抗氧化和抗炎作用。

土人参（Talinum paniculatum (Jacq.) Gaertn.）是一种原产于热带美洲的多年生草本植物，现已遍布泛热带地区，在西非、热带南美、东南亚和中国中南部均有栽培或归化。现代药理学研究表明，其根和叶含有多种代谢物，包括多糖、黄酮类、植物甾醇、生物碱、三萜类和有机酸等，这些成分赋予了土人参多种生物活性，如抗氧化、抗菌和抗真菌活性。然而，尚无研究比较该植物不同部位的活性，也未对其抗氧化机制进行深入探究。本研究旨在比较土人参地下部分（根，TP-ER）和地上部分（茎和叶，TP-ESL）乙醇提取物的抗氧化活性和细胞保护作用，并通过代谢组学分析、生物信息学靶点筛选、QSAR建模和分子对接等计算手段，初步探索其潜在的活性代谢物和分子机制。

二、主要关键技术方法

研究人员采用了多种关键技术方法开展研究。植物材料采集自中国贵州省罗甸县（2020年9月），凭证标本（编号20200923）存放于南华大学生物化学与分子生物学研究所。研究整合了以下核心技术：（1）基于超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）的广泛靶向代谢组学分析，利用Metware数据库进行代谢物注释，注释置信度分为三个等级；（2）基于基因表达综合数据库（GEO）中GSE47739数据集（含HepG2细胞经H₂O₂处理和未处理对照各四个生物学重复）的差异表达基因筛选、基因集富集分析（GSEA）和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，以确定核心靶点；（3）从ChEMBL数据库获取靶点抑制剂的生物活性数据，使用RDKit解析SMILES并利用Mordred包计算分子描述符，采用Kennard-Stone算法进行分层数据划分，系统评估31种机器学习算法构建QSAR分类模型；（4）使用AutoDock 4.2进行分子对接，以CDKN1A-PCNA（PDB 7KQ1）、JUN-NFAT1（PDB 1S9K）和PMAIP1-BFL-1（PDB 3MQP）复合物为受体，结合Borda排序函数筛选最优候选代谢物。

三、研究结果

3.1 总酚和总黄酮含量

通过NaNO₂-AlCl₃-NaOH法和Folin-Ciocalteu比色法分别测定总黄酮含量（TFC）和总酚含量（TPC）。结果显示，TP-ER的TPC和TFC分别为220.531 ± 7.113 mg GAE/g提取物和286.840 ± 12.882 mg RE/g提取物，均显著高于TP-ESL（分别为123.065 ± 0.620 mg GAE/g提取物和104.937 ± 2.427 mg RE/g提取物），表明根部的酚类和黄酮类物质含量显著高于茎叶部分。

3.2 抗氧化活性

通过DPPH、ABTS和FRAP三种体外实验评估抗氧化活性。TP-ER的DPPH IC₅₀值为0.241 ± 0.024 mg/mL，ABTS IC₅₀值为0.165 ± 0.007 mg/mL，均显著低于TP-ESL（分别为0.613 ± 0.038 mg/mL和0.483 ± 0.025 mg/mL），表明根部提取物具有更强的自由基清除能力。FRAP实验中，TP-ER的铁离子还原能力为50.637 ± 0.539 mmol Fe²⁺/g提取物，显著高于TP-ESL（28.808 ± 1.334 mmol Fe²⁺/g提取物），且接近阳性对照抗坏血酸（51.133 ± 0.090 mmol Fe²⁺/g提取物）。

3.3 细胞保护活性

在HepG2细胞氧化损伤模型中，H₂O₂的IC₅₀值为656.4 μmol/L，因此选用650 μmol/L H₂O₂诱导细胞损伤。两种提取物在0.25 mg/mL及以上浓度时表现出细胞毒性，因此0.2 mg/mL被设为最大安全浓度。TP-ER在0.05-0.20 mg/mL四个浓度下均显著提高细胞活力，但保护效应随浓度升高逐渐减弱；TP-ESL仅在0.1和0.15 mg/mL浓度下显著提高细胞活力。两种提取物的浓度-反应曲线均呈双相非线性特征。

3.4 提取物广泛靶向代谢组学分析

从TP-ER和TP-ESL中共注释了2371个代谢物，其中642个为一级注释（最高置信度），774个为二级注释，955个为三级注释。TP-ER中显著富集的注释代谢物有403个（其中150个仅在TP-ER中注释到），TP-ESL中显著富集的有886个（其中216个仅在TP-ESL中注释到）。黄酮类和酚酸类在TP-ER中占比较大，而萜类在TP-ESL中占主导。主成分分析（PCA）显示两种组织类型间清晰分离，QC样本紧密聚集；变异系数（CV）分析表明超过85%的代谢物CV < 0.3，实验数据高度稳定。

3.5 潜在胞内靶点选择与生物活性成分预测

基于GSEA富集分析，p53及其相关通路在所有数据库中均排在前三位。将通路相关基因与显著差异表达基因取交集后构建PPI网络，CDKN1A（p21）、JUN和PMAIP1（NOXA）按度中心性（DC）值排名前三，被确定为核心候选靶点。从ChEMBL共获取408个化合物，去除中间活性化合物后获得315个（含26个CDKN1A抑制剂、247个JUN抑制剂和42个PMAIP1抑制剂），按8:2比例划分为训练集（249个）和测试集（66个）。经31种机器学习算法系统评估，BalancedRandomForest分类器表现最佳，在测试集上达到准确率0.8636、精确率1.0、召回率0.7、F1值0.8235、AUC 0.9509、MCC 0.7483。取排名前五的模型（BalancedRandomForest、RandomForest、RandomForest_Entropy、KNN_weighted和Voting_Soft）对一级注释代谢物的预测结果取交集，获得三个计算预测的潜在活性代谢物，包括两个甾体和一个生物碱。

3.6 分子对接结果

分子对接结果显示，N-咖啡酰-4-O-甲基多巴胺在CDKN1A-PCNA和JUN-NFAT1复合物中排名第一，norflickinflimiod F在PMAIP1-BFL-1复合物中排名第一。N-咖啡酰-4-O-甲基多巴胺被预测与PCNA（PDB 7KQ1，链C）和NFAT1（PDB 1S9K，链C）结合；norflickinflimiod F被预测与PMAIP1-BFL-1复合物中的链A（BFL-1）和链B（NOXA）结合，其预测相互作用残基（Asn37、Phe38、Lys41、Leu42和Leu43）均位于NOXA的BH3结构域内。

四、讨论与结论

讨论部分提出了若干重要见解。在组织特异性代谢谱方面，TP-ER中黄酮类和酚酸类占主导，而TP-ESL中萜类占主导，这与根部更强的抗氧化活性一致。黄酮类和酚酸类富含羟基，其较低的键解离焓（BDE）有利于氢原子捐赠，可直接清除自由基并终止链式反应；而萜类双键的BDE较高，作为氢供体的效率可能较低。对于双相细胞保护反应，研究人员提出了五种可能的假说：狭窄的治疗窗口、浓度依赖的促氧化效应、粗提物中细胞毒性成分在高浓度下占主导、成分间复杂的协同或拮抗作用，以及类似毒物兴奋效应（hormesis）的适应性反应。在p53为中心的调控网络方面，p53在氧化应激中具有双重作用：轻度应激下激活抗氧化基因促进存活，重度应激下激活促凋亡基因清除受损细胞。CDKN1A、JUN和PMAIP1可能协同形成促凋亡网络。模型性能方面，QSAR模型存在过拟合和泛化稳定性有限的问题，应视为初步探索性筛选工具而非可靠的定量或靶点特异性预测器。分子对接结果仅提供结构假说，不能证明靶点抑制或蛋白质-蛋白质相互作用的调节。

研究结论指出，TP-ER相比TP-ESL具有更高的总酚和总黄酮含量以及更强的DPPH、ABTS和FRAP抗氧化活性；两种提取物均能改善H₂O₂诱导氧化应激下HepG2细胞的活力。代谢组学共注释了2371个代谢物，其中216个仅在TP-ESL中注释到、150个仅在TP-ER中注释到，包含642个高置信度注释。综合计算分析将CDKN1A、JUN和PMAIP1确定为潜在靶点，三个注释代谢物被预测为潜在活性物质。其中，N-咖啡酰-4-O-甲基多巴胺被预测与CDKN1A-PCNA和JUN-NFAT1复合物中的PCNA和NFAT1结合，norflickinflimiod F被预测结合于PMAIP1-BFL-1复合物中NOXA的BH3结构域界面。然而，这些机制解释仍属计算假说，候选代谢物未被分离或单独测试，QSAR模型泛化能力有限，分子对接无法证明靶点抑制，未来需要实验研究验证这些预测并阐明细胞保护机制。