IL-1β诱导肌腱祖细胞功能障碍中的铜敏感性代谢应激：一项体外与转录组学研究

《Antioxidants》：Copper-Sensitive Metabolic Stress in IL-1β-Induced Dysfunction of Tendon Progenitor Cells: An In Vitro and Transcriptomic Study

　　

肌腱病（tendinopathy）是一种复杂疾病，涉及炎症、氧化应激、细胞外基质损伤和细胞代谢改变。铜死亡（cuproptosis）是一种依赖铜的调节性细胞死亡，与线粒体蛋白脂酰化（lipoylation）和蛋白毒性应激相关。本研究探讨IL-1β诱导的肌腱祖细胞（TPCs）功能障碍是否伴随铜死亡相关基因变化，以及药理学调节铜可利用性是否改变该表型。研究人员以IL-1β刺激大鼠TPCs，暴露于氯化铜（CuCl₂）和铜离子载体elesclomol（ES），并与铜螯合剂四硫代钼酸盐（TTM）共处理。评估细胞代谢活性、基因表达和活性氧（ROS）产生。分析来自IL-1β处理大鼠TPCs的批量RNA测序（bulk RNA-sequencing）数据（GSE253913）和培养的人肌腱来源祖细胞的单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing）数据（GSE150482）。在大鼠中，转录组分析主要显示对IL-1β的炎症反应，铜和线粒体功能相关基因仅轻微变化。IL-1β降低TPC代谢活性及Scx、Col1a1和Col3a1等肌腱生成标志物表达，同时增加炎症和分解代谢标志物、ROS产生以及Dld和Lipt1表达。TTM减弱这些效应，恢复代谢活性和部分肌腱生成标志物，并降低ROS、Dld和Lipt1水平。暴露于ES + Cu触发TTM敏感表型，特征为代谢活性降低、肌腱生成基因表达下降、ROS水平升高及铜死亡相关基因表达改变。人单细胞数据集分析也揭示线粒体脂酰化基因的条件依赖性变化，包括DLAT和DLST。总体而言，这些发现提示炎症性TPC功能障碍与铜敏感性线粒体应激及铜死亡通路相关基因变化有关。

肌腱病（tendinopathy）是影响运动员和非运动员的复杂疾病，常由重复机械应力或过度使用引起，可显著损害患者生活质量和身体功能。其发病涉及重复机械负荷、细胞外基质（ECM）破坏、炎症、氧化应激、细胞功能障碍和修复受损。现有保守治疗可缓解症状，但手术治疗并发症风险较高；细胞治疗虽具潜在应用价值，却受衰老、衰老细胞和炎症挑战。肌腱祖细胞（TPCs）通过增殖和肌腱生成能力参与肌腱稳态与修复，但炎症和氧化微环境可损害其活力、分化和基质生成功能。IL-1β等促炎细胞因子可抑制肌腱生成表型、增加分解代谢并促进氧化应激，但IL-1β刺激不能复现肌腱病的全部机械、结构和多细胞特征，仅提供受控的体外炎症性TPC功能障碍模型。铜是维持线粒体呼吸、抗氧化防御、铁代谢和多种酶反应的重要微量元素；铜稳态失衡与神经退行性疾病、代谢综合征及肌肉骨骼和炎症性疾病相关。铜死亡是依赖铜的调节性细胞死亡，与线粒体蛋白脂酰化和蛋白毒性应激相关。炎症性TPC功能障碍与铜相关线粒体应激的关系仍未充分阐明，因此研究人员提出IL-1β暴露可能改变铜死亡相关代谢基因并增强TPC对铜诱导应激的敏感性，进而开展整合转录组与体外实验的研究。研究结果表明，IL-1β可引起以炎症和氧化为主的TPC功能障碍，并伴随部分铜死亡相关基因变化；铜螯合可部分减轻该表型，铜负荷可产生TTM敏感的重叠表型；但研究未证实内源性铜死亡是肌腱病的原因。其意义在于将炎症性TPC功能障碍与铜敏感性线粒体应激联系起来，并提出可进一步检验的机制假说。

方法概括：研究整合转录组发现与靶向体外分析。公共数据包括GSE253913（IL-1β处理大鼠TPCs的批量RNA测序数据）和GSE150482（培养的人髌腱来源祖细胞，机械刺激条件，每条件3名供体，单细胞RNA测序数据）。原代SD大鼠TPCs取自8周龄、250 g大鼠（n=3）跟腱，经IL-1β、TTM及CuCl₂ + ES处理；检测CCK-8代谢活性、qRT-PCR基因表达和H₂DCF-DA ROS荧光。生物信息分析采用limma、基因集富集分析（GSEA）、Scanpy/scVI及供体水平伪批量（pseudobulk）差异分析。

结果部分：
3.1 IL-1β诱导炎症转录组反应，伴铜死亡相关基因轻微变化。通过GSE253913差异表达分析，研究人员发现IL-1β处理组有678个差异表达基因（DEGs），其中480个上调、198个下调，炎症介质如Ptx3、Ntn1、Ccl2、Ccl7、Ccl20和Cxcl3明显上调。预设的铜转运、线粒体脂酰化和铜死亡相关基因均未达到全基因组DEG标准，但Dld、Gcsh和Slc31a1在校正p<0.05下呈轻微变化。GO和KEGG富集主要指向炎症反应。该结果提示IL-1β主要引发炎症转录组反应，而非广泛激活铜死亡程序，且转录组数据不能证明内源性铜积累或铜毒性易感性增加。
3.2 基因集富集分析揭示IL-1β处理TPCs中协调的炎症激活和结构程序抑制。通过对全排序基因列表进行GSEA，研究人员发现脂多糖、细菌分子、生物刺激和IL-1反应相关GO生物学过程正向富集，而钾离子跨膜转运、周细胞分化、肌动蛋白肌球蛋白结构组织、肌节组织和肌肉组织形态发生负向富集。KEGG分析显示细胞因子—细胞因子受体相互作用、IL-17、TNF、趋化因子信号等通路富集；类风湿关节炎等疾病通路应视为共享炎症基因群，而非TPCs发生这些疾病。结论是IL-1β协调激活炎症和固有免疫程序，同时抑制结构、细胞骨架和离子转运相关程序。
3.3 IL-1β诱导大鼠TPCs炎症、分解代谢表型并改变选定线粒体代谢基因。通过原代大鼠TPC实验，研究人员观察到IL-1β降低CCK-8代谢活性，降低Scx、Col1a1和Col3a1表达，升高Il6、Mmp3和Mmp13表达及H₂DCF-DA荧光，并上调Dld和Lipt1，而Mtf1和Cdkn2a不变。结论是IL-1β造成炎症、氧化、分解代谢和肌腱生成功能障碍表型，并对选定铜死亡相关基因产生有限而非全面的转录重塑。
3.4 TTM减弱IL-1β诱导TPC功能障碍的部分特征。通过IL-1β与TTM共处理，研究人员发现TTM提高CCK-8代谢活性，恢复Scx和Col1a1表达但不显著恢复Col3a1，降低Dld和Lipt1表达并减少ROS相关荧光。结论是铜螯合可影响IL-1β引起的部分代谢、氧化和肌腱生成反应，但TTM并非铜死亡特异性抑制剂，其保护作用不能单独证明抑制铜死亡。
3.5 ES + Cu药理学铜负荷导致TTM敏感的TPC功能障碍表型。通过CuCl₂、ES和TTM处理，研究人员发现CuCl₂浓度依赖性降低代谢活性，ES单独无明显影响，ES + Cu显著降低代谢活性且TTM可减弱；ES + Cu降低Scx和Col1a1、升高Dld和Lipt1及ROS，TTM可逆转这些变化。结论是药理学升高细胞内铜可产生与IL-1β诱导表型部分重叠的TTM敏感应激表型，但该表型与铜死亡一致而非确证铜死亡。
3.6 人TPC单细胞分析揭示线粒体脂酰化基因表达的条件相关变化。通过GSE150482单细胞RNA测序、scVI整合和供体水平pseudobulk分析，研究人员观察到铜调控、线粒体功能、蛋白脂酰化和铜死亡相关基因呈条件依赖性差异；DLAT升高而DLST降低，提示线粒体TCA循环相关代谢重塑。复合铜死亡相关表达评分仅反映通路相关转录，不能证明DLAT脂酰化、铜结合、蛋白聚集或铜死亡活性。结论是人肌腱来源细胞存在铜和/或铜死亡相关转录程序重塑，但未确认铜死亡细胞死亡。

讨论部分总结：讨论指出，IL-1β诱导的TPC表型以代谢活性下降、肌腱生成和基质基因抑制、炎症和分解代谢转录增加及ROS相关荧光升高为特征；主要附加发现是该表型伴随部分线粒体脂酰化和铜死亡相关代谢基因改变，并可被铜螯合部分修饰；ES + Cu产生重叠的TTM敏感表型。大鼠转录组主要提供炎症背景，GSEA突出炎症和结构过程而非铜死亡特异性通路，铜相关信号较为间接。TTM可影响铜依赖酶、氧化还原和炎症信号，不能作为铜死亡通路特异性证据；ES + Cu降低CCK-8和增加ROS也非通路特异。人单细胞数据中DLAT升高和DLST降低提示线粒体代谢重塑，但转录水平不能证明脂酰化、铜结合、蛋白聚集或铜死亡活性。局限性包括未测细胞内铜水平和分布、未检测脂酰化DLAT聚集、铁硫簇蛋白失稳和蛋白毒性应激，TTM可能具有铜死亡以外的作用，转录组分析仅提示关联而非因果。优势在于整合转录组与特征明确的原代大鼠TPC功能实验，采用阈值依赖差异表达和无阈值GSEA，并从铜负荷和铜螯合两个方向评估铜敏感性。

研究结论翻译：IL-1β在大鼠TPCs中触发炎症、分解代谢、氧化和肌腱生成功能障碍，并影响参与线粒体脂酰化和铜死亡相关代谢的特定基因表达。TTM铜螯合减轻该表型的若干方面，而药理学诱导的ES + Cu应激引起类似的代谢、转录和氧化变化，且同样对TTM有反应。大鼠批量RNA测序和人单细胞转录组分析均进一步揭示炎症和线粒体代谢通路的改变。这些发现提示炎症性TPC功能障碍与铜敏感性线粒体应激之间存在关联。因此，铜死亡相关机制应被视为TPC功能障碍中有待检验的潜在因素，而不是肌腱病的已确认原因。