《Antioxidants》：Fermented Houttuynia cordata Thunb. Attenuates Dextran Sulfate Sodium-Induced Colitis in Mice, Associated with Preserved Gut Barrier Integrity and Reduced Colonic TLR4 Expression
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鱼腥草（Houttuynia cordata）在亚洲地区常作为药食两用植物及传统药材被食用。尽管发酵鱼腥草产品作为天然健康产品日益流行，但其在实验性结肠炎模型中的作用仍不清楚。本研究探讨了发酵鱼腥草提取物（fermented H. cordata extrac
鱼腥草（Houttuynia cordata）在亚洲地区常作为药食两用植物及传统药材被食用。尽管发酵鱼腥草产品作为天然健康产品日益流行，但其在实验性结肠炎模型中的作用仍不清楚。本研究探讨了发酵鱼腥草提取物（fermented H. cordata extract, FHE）及发酵鱼腥草汁（fermented H. cordata juice, FHJ）在葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium, DSS）诱导的结肠炎小鼠中的保护作用。研究人员采用高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography, HPLC）分析FHE与FHJ中的生物活性成分，并经质谱法（mass spectrometry, MS）确认，同时与非发酵鱼腥草提取物进行比较。发酵产品中没食子酸、槲皮素、异槲皮苷及有机酸（包括乳酸、葡萄糖醛酸、丁酸和乙酸）含量较高，而咖啡酸、芦丁、总酚及总黄酮含量较低。在动物实验中，雄性C57BL/6小鼠分别接受500或1000 mg/kg的FHE及200或400 mg/kg的FHJ作为低、高剂量，连续给药23天，并于第15–21天在饮水中给予2.5% DSS，第22–23天更换为不含DSS的饮水。FHE与FHJ预处理可减轻诱导性结肠炎的严重程度，表现为体重下降减少、疾病活动指数（disease activity index, DAI）降低、结肠长度恢复（FHJ 400 mg/kg组为8.82 ± 0.29 cm，DSS组为7.53 ± 0.08 cm，p < 0.001），并防止组织病理学损伤，其中FHE 500 mg/kg及FHJ 400 mg/kg处理组效果最为显著。肠道屏障完整性得以维持，表现为FITC-葡聚糖通透性降低（FHJ 400 mg/kg组为570 ± 56 ng/mL，DSS组为1963 ± 183 ng/mL，p < 0.001）、结肠Muc2 mRNA水平升高（FHJ两个剂量组均显著），以及紧密连接蛋白ZO-1（FHE 1000 mg/kg组）和claudin-1（FHE两个剂量组及FHJ 400 mg/kg组）表达上调。此外，FHE与FHJ预处理均降低结肠TNF-α和IL-1β的mRNA表达，而IL-6仅在FHE处理下降低，同时FHE 1000 mg/kg及FHJ两个剂量组结肠TLR4表达减少。各组间IκB-α及NF-κB p65的磷酸化/总蛋白比值无显著差异。FHE与FHJ对DSS诱导的结肠炎发挥保护作用，其机制与维持肠道屏障功能及降低结肠TLR4表达相关。
炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）是一种持续且复发的胃肠道炎症性疾病，主要包括克罗恩病（Crohn's disease, CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC），近年来全球患病率不断上升，给患者生活质量带来严重影响并造成巨大经济负担。IBD的发病机制涉及遗传变异、肠道菌群失调、肠道屏障功能障碍、免疫失调及环境因素等多重复杂相互作用。研究表明，肠道屏障功能受损及肠道菌群紊乱与IBD的发生发展密切相关。屏障破坏导致紧密连接蛋白调控异常和旁细胞通透性增加，使脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）等革兰氏阴性菌外膜成分穿过受损上皮屏障，激活核因子κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）/Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）信号通路，放大炎症反应。由于传统治疗药物如氨基水杨酸类、糖皮质激素及免疫抑制剂在维持长期缓解方面存在局限并可能产生显著不良反应，因此寻找膳食及补充疗法以预防或减轻肠道炎症具有重要意义。
鱼腥草（Houttuynia cordata Thunb.）是Saururaceae科多年生草本植物，在多个亚洲国家长期作为药用植物、功能性食品及传统疗法使用，用于治疗炎症性疾病和胃肠道疾病。鱼腥草含有槲皮素、槲皮苷、芦丁、绿原酸等多种生物活性植物化学物质，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗病毒及免疫调节等生物活性。近年来，发酵鱼腥草产品作为天然健康产品日益受到关注。发酵过程通过生物转化产生代谢物，改变食品的风味、营养价值及功能特性，益生菌发酵食品可增强宿主肠道菌群、改善免疫功能并促进消化健康。已有研究表明，发酵鱼腥草可提高多酚和β-葡聚糖等植物化学物质含量，并具有心脏保护、抗炎及改善代谢等作用。然而，发酵鱼腥草作为功能性食品在肠道炎症尤其是IBD中的作用尚未得到充分研究。为此，研究人员开展了本研究，探讨发酵鱼腥草提取物（fermented H. cordata extract, FHE）和发酵鱼腥草汁（fermented H. cordata juice, FHJ）在葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium, DSS）诱导的结肠炎小鼠模型中的保护作用，并考察其对肠道屏障完整性、结肠脂质过氧化、炎症细胞因子表达及结肠TLR4表达的影响。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：高效液相色谱法（high-performance liquid chromatography, HPLC）结合液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（LC-QTOF-MS）鉴定生物活性化合物及有机酸；Folin–Ciocalteu比色法测定总酚含量（total phenolic content, TPC）；氯化铝比色法测定总黄酮含量（total flavonoid content, TFC）；动物实验采用雄性C57BL/6小鼠（6–8周龄，24–29 g，购自Nomura Siam International Co., Ltd.，泰国曼谷），随机分为6组，每组8只，FHE（500、1000 mg/kg）和FHJ（200、400 mg/kg）连续灌胃23天，第15–21天通过饮水给予2.5% DSS诱导急性结肠炎；FITC-葡聚糖实验检测肠道通透性；苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色及过碘酸-雪夫（periodic acid–Schiff, PAS）染色进行组织病理学评估；硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances, TBARS）法测定丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平；实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）检测基因表达；蛋白质印迹法（Western blot）检测蛋白表达。
研究结果如下。生物活性化合物、有机酸及植物化学组成：HPLC分析显示，FHE中没食子酸浓度最高，其次为FHJ，NFHE中最低；咖啡酸在NFHE中浓度最高，发酵后显著降低。槲皮素和异槲皮苷在FHE中最丰富，其次为FHJ，NFHE中最低；与NFHE相比，FHE中槲皮素和异槲皮苷分别增加3.13倍和1.8倍，FHJ中分别增加1.36倍和1.19倍。芦丁在NFHE中浓度最高，发酵后显著降低。有机酸分析显示，乳酸和葡萄糖醛酸在发酵产品中高于NFHE，FHJ中最高；丁酸和乙酸在NFHE中未检出，但在两种发酵产品中均存在，FHJ中高于FHE。TPC和TFC在发酵产品中均低于NFHE，TPC从NFHE的129.65 mg GAE/g降至FHE的105.68和FHJ的55.68 mg GAE/g，TFC呈现类似趋势。DSS诱导结肠炎的临床严重程度：DSS组小鼠从第5天起体重显著下降，DAI评分在第7天显著升高；FHE和FHJ预处理显著减轻体重下降并降低DAI评分。DSS显著缩短结肠长度，FHE和FHJ预处理显著改善结肠缩短；脾脏重量在FHE和FHJ所有剂量组均显著低于DSS组。结肠组织病理学变化：正常组结肠上皮结构完整，隐窝排列整齐，杯状细胞丰富；DSS组出现隐窝扭曲、隐窝丢失、广泛上皮侵蚀及黏膜内显著炎症细胞浸润，组织病理学指数显著升高。FHEL和FHJH预处理显著减轻组织学异常并降低组织病理学指数，FHEH和FHJL产生较小且不显著的降低。肠道屏障功能：正常组PAS阳性杯状细胞丰富，DSS组PAS反应减弱，FHE和FHJ预处理改善PAS染色减少。DSS组Muc2 mRNA表达显著低于正常组，FHJ两个剂量组均显著升高Muc2 mRNA表达。DSS组血清FITC-葡聚糖水平显著高于正常组，FHE和FHJ预处理组均显著降低，FHJH组与正常组相当。Western blot显示，DSS组ZO-1蛋白表达显著低于正常组，FHEH预处理显著增强ZO-1表达；claudin-1在DSS处理下显著降低，FHEL、FHEH和FHJH预处理后显著升高。结肠氧化应激与炎症反应：DSS组MDA水平显著高于正常组，FHEH、FHJL和FHJH预处理显著降低MDA水平，FHJH组最低。DSS显著增加TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达，FHE预处理显著降低三者表达，FHEH抑制作用强于FHEL；FHJ两个剂量均显著降低TNF-α和IL-1β表达，但IL-6 mRNA未见显著降低。TLR4/NF-κB信号通路：DSS组结肠TLR4表达显著高于正常组，FHE 1000 mg/kg及FHJ两个剂量组TLR4表达显著低于DSS组，FHE 500 mg/kg组未达统计学显著。p-IκB-α/IκB-α和p-NF-κB p65/NF-κB p65比值在各组间无显著差异。
讨论部分指出，发酵改变了鱼腥草的多酚组成，降低咖啡酸和芦丁含量而增加槲皮素和异槲皮苷含量，这与微生物生物转化机制一致，包括糖基化黄酮水解为相应苷元，苷元可能具有更高生物利用度。发酵还增加了乳酸、乙酸、丁酸和葡萄糖醛酸含量，这些代谢物据报道可调节肠道稳态和肠道菌群。FHE和FHJ预处理减轻DSS诱导的肠道屏障功能障碍，降低血清FITC-葡聚糖浓度，保护分泌黏蛋白的杯状细胞并上调Muc2 mRNA表达，逆转ZO-1和claudin-1的降低。FHE和FHJ降低结肠促炎细胞因子IL-1β和TNF-α mRNA水平，IL-6仅在FHE处理下降低。TLR4表达在多数处理组降低，但IκB-α和NF-κB p65磷酸化比值无显著差异，因此现有数据不足以证明FHE或FHJ直接抑制NF-κB激活。研究存在若干局限性，包括未设非发酵提取物组、未设阳性对照组、发酵微生物未表征、未测量结肠短链脂肪酸、未采用计算机随机分组、仅使用雄性小鼠及急性结肠炎模型等。
研究结论：本研究结果表明，FHE和FHJ在实验性小鼠结肠炎模型中是具有抗炎特性的功能性化合物的有前景来源。与非发酵提取物相比，两种发酵产品含有更高水平的没食子酸、槲皮素、异槲皮苷和有机酸，以及更低水平的咖啡酸、芦丁和总酚及总黄酮含量。与DSS处理组相比，FHE和FHJ预处理减轻了临床症状，减少了组织病理学损伤，维持了肠道屏障完整性，降低了结肠脂质过氧化，并减少了炎症细胞因子表达。这些效应伴随大多数处理组结肠TLR4表达降低，而IκB-α和NF-κB p65的磷酸化比值未改变。发酵是否增强鱼腥草的疗效以及这些效应与标准治疗药物相比如何仍有待研究。上述结果凸显了FHE和FHJ作为预防肠道炎症的候选功能性食品成分的潜力，在推断其对人类疾病的相关性之前，需要进一步的机制和比较研究。
