过滤增强双模式SERS生物传感器用于饮用水水源性病原菌的快速龙头端检测

《Biosensors》：Filtration-Enhanced Dual-Mode SERS Biosensor for Rapid On-Tap Detection of Waterborne Pathogens in Drinking Water

　　

摘要专业翻译 确保饮用水的微生物安全性对公共卫生和食品生产至关重要。然而，传统平板计数法耗时长，难以满足病原微生物快速现场检测的需求。本研究提出一种过滤增强双模式表面增强拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS）生物传感器，用于饮用水水源性病原菌的快速、免培养检测，该传感器可直接集成于家用龙头。该生物传感器将多孔滤膜与金纳米颗粒（Au nanoparticles, AuNPs）相结合，可同步实现水源性细菌的富集与SERS信号的显著放大。双模式设计提供了可视化比色响应，基底颜色随细菌载量增加而逐渐变化，可实现水污染程度的初步半定量评估。此外，该生物传感器实现了最低实验可检测细菌载量为103 CFU/平台。进一步采用支持向量机（Support Vector Machine, SVM）算法对不同类型病原菌进行判别，分类准确率达96%。对家用净水器的实际检测表明，微生物污染随使用时间累积增加，与传统平板计数结果高度一致。所开发的生物传感平台为家庭场景及食品相关环境中饮用水安全的现场监测提供了一种快速（10分钟内）、灵敏且用户友好的检测工具。

论文解读

一、研究背景与意义

饮用水微生物污染是全球公共卫生面临的持续性重大威胁。据世界卫生组织2023年报告，全球超过20亿人生活在水资源紧张地区，其中至少17亿人日常依赖受粪便污染的地表水或浅层地下水。微生物污染的饮用水是腹泻、霍乱、痢疾、伤寒和脊髓灰质炎等传染病的主要致病来源，每年导致约50.5万人死于腹泻相关疾病。

尽管近几十年来水微生物检测技术取得了显著进展，但灵敏度、检测速度、特异性和成本效益之间始终存在难以兼顾的瓶颈。传统平板计数法和膜过滤培养法虽成本低廉，但需要漫长的培养周期，无法对突发水污染事件提供快速预警。现有免培养快速检测技术各有局限：聚合酶链式反应（PCR）虽可实现灵敏的细菌DNA检测，但无法区分活菌与死菌；三磷酸腺苷（ATP）生物发光法可快速定量活微生物，但缺乏精确的菌种鉴定能力；DNA微阵列技术虽支持高通量多病原体检测，但在低浓度水样分析时性能显著下降。

表面增强拉曼散射（SERS）技术凭借抗干扰能力强、响应快、灵敏度高和无损检测等优势，为饮用水质量监测提供了有力工具。然而，现有SERS细菌检测方法大多依赖复杂的手工操作或精密制备工艺，且需要繁琐的样品前处理，严重限制了其在实际场景中的推广应用。终端家庭饮用水基质相对洁净但细菌丰度极低，对细菌富集效率和检测灵敏度提出了严苛要求。因此，亟需开发一种可在短时间内高效、准确检测水中病原菌的普适性检测系统。

二、研究内容概述

针对上述问题，研究人员提出了一种过滤增强双模式SERS生物传感器，将多孔聚偏氟乙烯（PVDF）滤膜与金纳米颗粒（AuNPs）集成，实现细菌的一步分离、原位富集和原位SERS信号放大。该系统集成了比色半定量筛查与高精度无标记SERS指纹分析两种互补检测模式，并构建了可直连家用龙头的紧凑型过滤检测装置，实现出水过程中的实时原位水质监测。整个检测流程缩短至约10分钟，相比传统平板培养法大幅提升了分析效率。

三、关键技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：其一，通过经典Lee–Meisel法合成AuNPs胶体，并采用真空过滤法将AuNPs负载于PVDF微孔滤膜上，构建过滤增强型SERS活性基底，利用纳米颗粒间形成的密集电磁“热点”网络实现信号放大；其二，采用便携式拉曼光谱仪（激发波长785 nm，激光功率150 mW，积分时间20 s）采集细菌SERS指纹光谱；其三，利用智能手机拍摄膜样品并结合ImageJ软件提取红绿蓝（RGB）通道强度值，建立加权综合颜色强度进行比色半定量分析；其四，采用鲸鱼优化算法（WOA）优化支持向量机（SVM）超参数，建立病原菌分类判别模型；其五，以传统平板培养法（依据中国国家标准GB 5749-2022）作为对照验证检测准确性。细菌菌株（大肠杆菌ATCC25922等）来源于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）。

四、研究结果

传感器性能优化。 研究人员系统考察了AuNPs负载量对SERS增强效果的影响。扫描电子显微镜（SEM）表征显示，当AuNPs胶体过滤量从0.5 mL增至2 mL时，颗粒间距逐渐减小。最佳SERS增强效果在表面密度为166 ± 8 NPs/μm2（每传感器1 mL胶体）时获得，增强因子（EF）约为1.2 × 10?；超过209 ± 5 NPs/μm2的负载量则引发AuNPs聚集，破坏热点均匀性并降低SERS强度。

均匀性、重现性与稳定性评估。 在每片富集大肠杆菌的传感器膜上随机选取10个点采集SERS光谱，723 cm?1特征峰强度的相对标准偏差（RSD）为14.02%，验证了良好的信号空间均匀性。5个独立批次传感器间的RSD为7.21%，表明批次间重现性可接受。在4 °C储存30、120和160天后，SERS信号强度分别保留初始值的72.47%、64.90%和54.94%，特征指纹峰仍清晰可辨，展现出良好的长期稳定性，支持样品的存档保存与回溯分析。

比色响应与半定量分析。 大肠杆菌与AuNPs在膜上的均匀固定产生了浓度依赖的比色响应，细菌载量与颜色强度间建立了良好的线性关系（R2 = 0.99）。金黄色葡萄球菌的平行测试同样呈现从酒红色到深蓝色的规律性颜色转变，证明该传感器对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有广谱响应能力，可通过目视比色实现未知混合病原菌的快速初步筛查。

SERS检测与高精度定量分析。 将一维拉曼光谱转换为二维等高线图后，空白传感器呈现均匀蓝色背景和极低背景干扰；大肠杆菌富集基底在723、1314和1582 cm?1处出现清晰特征谱带，且信号亮度随细菌浓度同步增强。在1100–1600 cm?1范围内，等高线颜色随细菌丰度增加由蓝转绿，源于细菌细胞的固有生物分子指纹峰。该传感器在低至103 CFU/平台的浓度下仍可获得可分辨的细菌指纹信号。基于40个均匀分布采样点的平均积分峰面积建立指数定量校准曲线，R2 = 0.98，且该策略对福氏志贺菌、鼠伤寒沙门氏菌和副溶血性弧菌均具有普适性。

SVM病原菌分类识别。 选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺菌、鼠伤寒沙门氏菌和副溶血性弧菌五种常见病原菌建立判别模型，提取500–1800 cm?1特征范围内的原始SERS光谱作为SVM输入特征。经WOA优化超参数后，训练集分类准确率达100%，独立测试集预测准确率达96.04%，实现了光谱指纹与菌种间的精确匹配。

混合细菌检测性能。 制备含金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的混合菌样模拟实际混合污染场景，SERS特征信号在103–10? CFU/平台范围内随总菌浓度呈现规律稳定变化，积分峰面积与总混合菌浓度对数间线性关系良好（R2 = 0.98），最低实验可检测总菌载量为103 CFU/平台。

家用净水器出水实际应用。 对运行6个月和12个月的家用净水器出水进行检测，商用瓶装水的拉曼信号接近基底信号，而家用净水器出水在1250–1600 cm?1范围内出现清晰细菌指纹信号，且信号强度与净水器使用时长呈正相关，表明长期运行中微生物污染逐渐累积。定量结果与传统平板计数法高度一致，提示长期服役的家用净水器易发生严重微生物污染，定期维护、及时更换滤芯和持续微生物监测至关重要。

五、讨论与结论

讨论部分指出，与传统SERS检测平台相比，该过滤增强双模式传感器具有显著优势：AuNPs组装的微孔基底通过一步真空过滤制备，无需生物识别探针或多步功能化，可实现低成本规模化生产；无标记传感设计支持混合菌样的便捷广谱筛查；比色与SERS双模式集成可快速目视评估污染水平；可动态调节的过滤采样体积有效富集家庭饮用水中的痕量病原菌，显著提升超低丰度微生物污染的检测可靠性。研究同时承认若干局限性：当前平台无法有效区分活菌、活的但不可培养（VBNC）状态菌和死菌；103 CFU/平台为最低实验可检测浓度而非严格计算的检出限（LOD）。未来工作将聚焦系统化VBNC验证与定量LOD计算、深度学习光谱分析与智能手机读数集成，以及向自动化高精度现场监测的扩展。

结论部分总结：本研究通过将微孔滤膜与AuNPs集成，合理设计了一种过滤增强双模式SERS生物传感器。AuNPs在多孔膜内的可控分布产生了丰富的SERS“热点”，显著增强了目标病原菌的拉曼指纹信号。基于此设计构建的新型垂直流检测平台可实现水源性病原菌的快速富集和污染水平的准确评估。该传感器实现了高效细菌富集和强SERS信号放大，可在短时间内灵敏检测低浓度病原菌，并提供水样总菌数的初步定性和半定量分析。凭借其用户友好配置，该过滤检测装置可直接安装于家用龙头，为饮用水质量的实时监测提供了一种简便实用的方法。