氯托诺菌素A抗恶性疟原虫配子体细胞及潜在传播阻断活性的表征

《Pharmaceutics》：Characterization of the Gametocytocidal and Putative Transmission-Blocking Activity of Chlorotonil A Against Plasmodium falciparum

　　

背景：氯托诺菌素A（Chlorotonil A）是一种由黏细菌纤维素黏球菌（Sorangium cellulosum）产生的酮基大环内酯类化合物，具有强效的抗生素和抗疟活性。值得注意的是，氯托诺菌素A对疟疾寄生虫的无性血期和有性血期均具有活性，使其成为开发既能治疗疟疾又能减少寄生虫向蚊媒传播制剂的候选药物。目的：本文旨在表征氯托诺菌素A的配子体杀灭活性及传播阻断活性。方法与结果：研究人员利用来自加蓬疟疾流行区的恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）临床分离株进行直接膜饲喂试验（direct membrane feeding assay，DMFA），结果表明氯托诺菌素A可降低冈比亚按蚊（Anopheles gambiae，Kisumu品系）的卵囊感染率与感染强度。此外，研究人员证明氯托诺菌素A在体外是一种起效尤为快速的配子体杀灭化合物。荧光显微镜和透射电子显微镜观察显示，氯托诺菌素A在药物暴露6小时后即损害膜完整性并诱导细胞内空泡化，24小时后出现活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累和细胞内酸化。结论：研究结果表明，氯托诺菌素A具有开发为双活性抗疟药物的潜力。

**氯托诺菌素A抗恶性疟原虫配子体细胞及潜在传播阻断活性的表征**

**1. 研究背景与问题**

疟疾仍然是全球重要的公共卫生威胁，2024年估计有2.82亿病例和61万例死亡，其中大部分疾病负担集中在撒哈拉以南非洲，主要由恶性疟原虫（*Plasmodium falciparum*）引起。当前无并发症疟疾的治疗依赖以青蒿素为基础的联合疗法（artemisinin-based combination therapies，ACTs），此类药物能迅速杀灭无性血期寄生虫，但对未成熟配子体（I–III期）作用有限，对成熟配子体（IV/V期）缺乏直接活性。目前仅普利马喹（primaquine）和他非诺喹（tafenoquine）对成熟配子体有效，世界卫生组织建议在标准ACT疗程后加用单剂量0.25 mg/kg普利马喹以减少传播，但该建议尚未常规实施。与此同时，东南亚和东非已出现部分青蒿素耐药性，且对苯芴醇敏感性降低的标志物也已出现。虽然现有ACTs大部分仍维持WHO定义的90%以上PCR校正疗效，但未来必须开发低耐药倾向且能阻断传播的干预策略。配子体因代谢活性低、不增殖且药物摄取特性与无性血期不同，使其成为药物研发的困难靶点。氯托诺菌素A（Chlorotonil A）是一种由土壤黏细菌纤维素黏球菌（*Sorangium cellulosum*）产生的酮基大环内酯类抗生素，体外和体内研究已显示其对恶性疟原虫无性血期具有强效杀灭活性，且其配子体杀灭速度仅次于当前起效最快的青蒿琥酯。然而，氯托诺菌素A的配子体杀灭活性是否能转化为传播阻断效应，及其配子体杀灭的作用机制尚不清楚。填补这一知识空白将有助于将氯托诺菌素类化合物定位为符合“抗疟药物风险投资联盟”（Medicines for Malaria Venture）目标候选特征5（Target Candidate profile 5，TCP5）的传播阻断药物。因此，本研究旨在进一步表征氯托诺菌素A的配子体杀灭活性和潜在传播阻断活性。

**2. 研究内容与结论**

研究人员采用来自加蓬疟疾流行区的恶性疟原虫临床分离株开展直接膜饲喂试验（direct membrane feeding assay，DMFA），评价氯托诺菌素A在接近自然条件下是否能够减少寄生虫向冈比亚按蚊（*Anopheles gambiae*，Kisumu品系）的传播。结果显示，氯托诺菌素A在不影响蚊虫存活率的前提下，以剂量依赖方式降低蚊虫卵囊感染率和感染强度。1 μM氯托诺菌素A完全阻断传播，500 nM可将感染率中位数降至0%，而50 nM的活性有限。在加入24小时预孵育步骤的DMFA中，500 nM和1 μM氯托诺菌素A同样完全阻断传播，50 nM则降低感染率和卵囊计数。研究人员进一步测定了氯托诺菌素A对成熟配子体的起效速度，结果显示其在6小时孵育后即表现出双位数纳摩尔级IC50（约35 nM），表明其是一种快速起效的配子体杀灭化合物，明显快于阳性对照亚甲蓝和环氧霉素。荧光显微术和透射电子显微镜观察发现，氯托诺菌素A处理5小时后即出现质膜完整性损伤，24小时后观察到细胞内酸化和活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累；超微结构分析显示配子体出现严重细胞内空泡化、食物泡形态异常和线粒体嵴结构损伤，但细胞核完整性未受影响。

**3. 关键技术与方法**

研究使用的核心技术方法包括：（1）直接膜饲喂试验（DMFA），使用来自加蓬兰巴雷内医学研究中心（CERMEL）收集的恶性疟原虫临床分离株（纳入标准为年龄≥5岁、单一恶性疟原虫感染，排除近期使用抗疟药物等）制备含配子体血餐，经药物添加后饲喂50只饥饿的冈比亚按蚊Kisumu品系，6–9天后解剖蚊虫中肠计数卵囊；（2）为模拟自然服药后配子体再被蚊虫摄取的场景，部分DMFA增加24小时药物与血液预孵育步骤；（3）使用基于荧光素酶的BacTiter-GLO试剂检测ATP水平，对成熟配子体进行不同时长药物暴露后测定IC50以评估起效速度；（4）采用多种荧光染料（Sytox Green、Hoechst 34580、吖啶橙、CM-H2DCFDA）结合荧光显微镜定性评估膜完整性、核完整性、胞内酸化和ROS水平；（5）使用透射电子显微镜（TEM）观察药物处理后的配子体超微结构变化。

**4. 研究结果**

**4.1 氯托诺菌素A不影响蚊虫存活率**
研究人员通过DMFA评估传播阻断潜力，分别以仅血清、0.1% DMSO（阴性对照）、5 μM亚甲蓝（阳性对照）以及50 nM、500 nM、1 μM氯托诺菌素A配制血餐饲喂蚊虫，观察到各处理组在解剖当日（饲喂后6–9天）的蚊虫死亡率无明显差异，表明氯托诺菌素A无杀虫效应。

**4.2 氯托诺菌素A具有强效传播阻断作用**
基于四个临床分离株的DMFA结果显示，1 μM氯托诺菌素A使全部解剖蚊虫均未感染，完全阻止卵囊形成；500 nM时感染率中位数为0% [IQR：0–1.7%]，卵囊数中位数为0 [IQR：0–0]，仅2只蚊虫感染；50 nM时感染率中位数93.3% [IQR：76.7–95%]，卵囊数中位数3 [IQR：1–15]，低于DMSO对照（感染率中位数78.3% [IQR：72.5–87.5%]；卵囊数中位数9.5 [IQR：1–30.5]）。5 μM亚甲蓝将感染率中位数降至41.7% [IQR：25–53.3%]，卵囊数中位数降至0 [IQR：0–1]。在添加24小时预孵育的DMFA中（三个临床分离株），1 μM和500 nM氯托诺菌素A均完全阻断传播，50 nM氯托诺菌素A将感染率中位数降至33.3% [IQR：28.3–43.3%]，卵囊数中位数降至0 [IQR：0–1]，均优于DMSO对照（感染率中位数53.3% [IQR：48.3–75%]；卵囊数中位数1 [IQR：0–10.5]）。阳性对照5 μM亚甲蓝在该方案中也完全阻断传播。

**4.3 氯托诺菌素A对成熟恶性疟原虫配子体起效迅速**
通过不同孵育时间（2、6、12、24、48小时）的药物敏感性试验，研究人员发现氯托诺菌素A在6小时孵育时IC50约为35 nM，已显示出明显活性；而阳性对照亚甲蓝和环氧霉素在24小时前均未表现出明显抑制作用，仅在48小时才出现强效活性（亚甲蓝为三位数纳摩尔级IC50，环氧霉素仅在48小时出现明显活性）。这表明氯托诺菌素A具有快速起效的配子体杀灭特点。

**4.4 氯托诺菌素A损害膜完整性并诱导细胞内酸化和ROS产生**
成熟配子体经60 nM氯托诺菌素A处理5小时和24小时后，以荧光染料染色观察。Sytox Green染色显示未处理配子体无胞内荧光，而5小时药物处理即出现细胞核荧光信号，提示质膜完整性受损；Hoechst 34580染色显示处理24小时后细胞核仍呈非碎片化单点结构，核完整性未受影响；吖啶橙染色显示处理24小时后出现强烈胞内酸性区室积累，而未处理组无明显信号；CM-H2DCFDA染色显示处理24小时后出现明显ROS产生信号，表明ROS积累和酸化是时间依赖性的较迟效应。

**4.5 氯托诺菌素A诱导成熟配子体超微结构损伤**
透射电子显微镜观察未经处理的成熟配子体呈现典型形态：寄生虫占据感染红细胞大部分体积，细胞核完整，食物泡含电子致密的疟色素晶体，线粒体具嵴结构，内质网呈膨出膜性囊泡，嗜锇小体聚集于质膜附近。经170 nM氯托诺菌素A处理6小时后，配子体超微结构严重受损：胞质大部分被膨大畸形的食物泡和大型空泡占据，线粒体形态虽保留但嵴结构受损。经10 nM处理48小时后，可见类似胞内空泡化现象，并异常出现多个含疟色素的小型食物泡，核完整性未受影响，内质网精细结构丧失，部分嗜锇小体散布于胞质中。

**5. 讨论与结论**

讨论部分指出，DMFA是评估候选抗疟药物传播阻断活性的金标准方法，可同时反映配子体杀灭、配子体绝育、孢子杀灭及杀虫效应。使用疟疾流行区临床分离株能更真实地反映自然条件下寄生虫的遗传多样性和传播能力。研究发现氯托诺菌素A在1 μM浓度下完全阻断卵囊发育，其抑制水平与cipargamin和ganaplacide等新药报道的活性相当，且在5 μM下其阻断卵囊形成的效果强于已知强效传播阻断剂亚甲蓝。起效速度试验表明氯托诺菌素A在6小时即出现纳摩尔级活性，明显快于亚甲蓝和环氧霉素，提示其具备快速起效特性。荧光显微镜和电镜结果显示膜损伤是最早可检测到的效应，随后出现酸化和ROS积累，提示膜完整性的破坏可能是氯托诺菌素A配子体杀灭活性的起始事件，而酸化和ROS可能是细胞损伤后的继发效应；电镜观察到的广泛空泡化与既往多种抗疟化合物诱导的非典型、非调控性细胞死亡表型一致。研究局限性包括临床分离株数量有限、仅来自单一地区，且荧光和电镜实验仅有一个生物学重复，结果属于定性观察，尚未能确定确切的抗疟作用模式。研究结论指出，氯托诺菌素A有望用于开发双活性抗疟药物，既能治疗无性血期引起的疟疾症状，又能阻断向蚊媒的传播，从而在人群水平上减少疟疾传播。