绿色构建的姜黄素–L-精氨酸–叶酸生物杂化纳米材料（Cur-LA-FA BNMs）通过叶酸受体靶向增强三阴性乳腺癌治疗

《Pharmaceutics》：Substitution of Hydrophobic Tails on Hydrophilic Polyethyleneimine via Urethane Linkages Yields Cleavable Lipopolymers with Effective mRNA Delivery

　　

背景：通过将生物活性分子整合到杂化纳米结构中，绿色工程为选择性癌症治疗提供了有效策略。生物杂化纳米材料已成为一类创新的多功能纳米平台，由有机生物活性分子与纳米结构组分整合而成，形成具有增强胶体稳定性、溶解性、可调表面化学、活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成能力和增强抗癌疗效的协同纳米结构。方法：在本工作中，研究人员通过绿色共混过程合成了姜黄素–L-精氨酸–叶酸生物杂化纳米材料（curcumin–L-arginine–folic acid biohybrid nanomaterials，Cur-LA-FA BNMs），并通过X射线衍射（X-ray diffraction，XRD）、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared，FTIR）、X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）、动态光散射（dynamic light scattering，DLS）和高分辨透射电子显微镜（high-resolution transmission electron microscopy，HRTEM）进行表征。结果：合成的BNMs显示约50 nm的微晶尺寸，呈球形形貌，粒径为50–70 nm，流体动力学直径为151 nm（多分散指数（polydispersity index，PDI）=0.388），证实生物杂化形成成功。Cur-LA-FA BNMs对MDA-MB-231细胞表现出增强的细胞毒性，IC₅₀值为51.91 ± 2.65 μg/mL，而游离姜黄素为72.63 ± 1.50 μg/mL。机制研究显示显著的ROS生成、线粒体膜去极化、caspase-3（半胱天冬酶-3）活性升高1.5倍、Bax表达约上调1.8倍以及Bcl-2表达显著下调。荧光素异硫氰酸酯（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的Cur-LA-FA BNMs在叶酸受体过表达的MDA-MB-231细胞中的荧光强度约为HepG2细胞的23倍，表明受体相关细胞摄取增强。结论：这些发现表明Cur-LA-FA BNMs作为靶向乳腺癌治疗的生物杂化纳米系统具有良好潜力。

说明：所给英文标题与摘要及正文主题不一致；以下依据摘要和正文中Cur-LA-FA BNMs研究内容进行解读。

研究背景与问题：癌症是二十一世纪全球公共卫生面临的复杂疾病和主要死亡原因之一，其中三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）为缺乏雌激素受体、孕激素受体和人表皮生长因子受体-2表达的一种乳腺癌亚型，具有临床侵袭性和治疗挑战性。传统手术、放疗和系统化疗常伴随严重脱靶细胞毒性、多药耐药和选择性药物递送不足。姜黄素具有抗炎、抗氧化、促凋亡和抗血管生成等多重活性，并可通过调节核因子-κB、Bcl-2家族蛋白、Bax和caspase-3依赖性凋亡级联发挥抗癌作用；但游离姜黄素存在水溶性差、系统降解快、口服生物利用度低和肿瘤部位细胞内蓄积不足等药代动力学缺陷。L-精氨酸作为半必需阳离子氨基酸，可通过静电作用与负电荷癌细胞膜相互作用并促进一氧化氮生成；叶酸（folic acid，FA）可利用TNBC细胞叶酸受体α（folate receptor alpha，FRα）过表达实现受体介导内吞。因此，研究人员旨在将姜黄素、L-精氨酸和叶酸整合为单一生物杂化纳米系统，以增强抗癌活性、细胞渗透和选择性肿瘤靶向，同时减少对正常组织的毒性。

研究开展与意义：研究人员首次通过简便共混法合成Cur-LA-FA BNMs，并系统评价其结构、光学及抗TNBC活性。该策略被描述为易放大、可重复且环境可持续，符合绿色化学和可持续纳米材料制备原则。研究提供支持该纳米系统治疗效力的体外临床前证据，并表明其作为靶向TNBC生物杂化纳米系统的潜力。

主要关键技术方法（≤250字）：采用绿色共混法合成Cur-LA-FA BNMs；以XRD、FTIR、XPS、DLS和HRTEM进行结构、官能团、元素价态、流体动力学尺寸及形貌表征；以MTT法评价MDA-MB-231和HepG2细胞活力；以2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针检测细胞内ROS；以JC-1染色评估线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）；以间接ELISA测定caspase-3活性；以实时定量PCR（RT-qPCR）检测Bax和Bcl-2表达；以FITC标记进行细胞摄取荧光分析；MDA-MB-231（HTB-26）和HepG2（HB-8065）细胞系来源于美国典型培养物保藏中心（ATCC）。

研究结果：3.1 Formation Mechanism（形成机制）：研究采用0.25:1:1的Cur:LA:FA摩尔比，UV-Vis光谱峰位移动及游离姜黄素421 nm特征峰消失，提示氢键、静电作用和π-π堆叠形成稳定自组装纳米结构而非简单物理混合。3.2 XRD Analysis（XRD分析）：Cur-LA-FA BNMs呈无定形与部分有序晶域共存，微晶尺寸约50 nm，峰位对应叶酸、姜黄素和L-精氨酸的分子排列及相互作用，部分无定形可能改善水分散性和溶出行为。3.3 FTIR Spectroscopic Analysis（FTIR光谱分析）：去卷积光谱显示O-H/N-H宽化、β-二酮羰基、COO^-、酰胺II及胍基C=N等振动，证实三者间氢键、静电和分子组装，并与XRD结果一致。3.4 DLS and Zeta Potential Analysis（DLS与Zeta电位分析）：水动力直径151 nm、PDI=0.388；Zeta电位为?5.95 ± 4.38 mV，胶体稳定由弱静电排斥、空间稳定及氢键、π-π相互作用和水化层共同贡献。3.5 XPS Analysis（XPS分析）：C、N、O原子百分比分别为73.18%、6.65%和20.17%，C 1s、N 1s和O 1s峰证实C-C/C=C、C-N/C-O、O-C=O、-NH₃⁺和COO^-等化学环境，支持超分子组装。3.6 HRTEM Analysis（HRTEM分析）：颗粒呈球形，粒径50–70 nm，具核–壳及层层包覆形貌和半结晶特征，选区电子衍射（selected-area electron diffraction，SAED）呈弥散同心环；DLS尺寸较大与溶液中水化层及瞬态分子缔合有关。3.7 Anticancer Activity（抗癌活性）：3.7.1 MTT Assay（MTT实验）显示Cur-LA-FA BNMs对MDA-MB-231细胞的IC₅₀为51.91 ± 2.65 μg/mL，低于游离姜黄素的72.63 ± 1.50 μg/mL；3.7.2 Evaluation of the Cytotoxic Effects of Individual Carrier Components（载体组分细胞毒作用评价）显示等效浓度叶酸和L-精氨酸单独处理未显著影响细胞活力；3.7.3 Intercellular ROS Assay（细胞内ROS实验）显示DCF-DA绿色荧光显著增强，提示氧化应激参与抗癌作用；3.7.4 Mitochondrial Membrane Potential Assay（线粒体膜电位实验）显示JC-1红色荧光降低、绿色荧光增加，提示MMP去极化；3.7.5 Caspase-3 Protein Enzymatic Activity（caspase-3蛋白酶活性）显示活性约升高1.5倍；3.7.6 Gene Expression（基因表达）显示Bax约上调1.8倍、Bcl-2显著下调；3.7.7 FITC Labeling Cellular Uptake Assay（FITC标记细胞摄取实验）显示MDA-MB-231细胞荧光强度约为HepG2细胞的23倍，支持FR相关摄取增强。

讨论部分总结：讨论认为，Cur-LA-FA BNMs的形成依赖姜黄素羟基和羰基、L-精氨酸氨基和胍基以及叶酸氨基和羧基之间的氢键、静电作用和π-π堆叠，200 °C干燥促进分子固结和稳定无定形纳米结构形成。XRD、FTIR和XPS结果相互印证分子级杂化及超分子组织；HRTEM与DLS差异可由水化层和溶液态瞬态缔合解释。尽管Zeta电位较低，体系仍借助空间稳定、表面水化及分子间作用保持分散。抗癌机制涉及叶酸受体相关摄取、ROS生成、线粒体膜去极化和内源性线粒体凋亡通路激活；同时，载体组分单独无显著细胞毒性，提示抗癌活性主要与姜黄素递送改善有关，但结论也强调细胞毒效应不能完全归因于FR介导靶向，生物杂化纳米材料相关因素及姜黄素多重机制可能共同参与。

研究结论翻译：总之，研究人员通过绿色共混过程合成了姜黄素–L-精氨酸–叶酸（Cur-LA-FA）BNMs，并对其结构、光学和生物医学应用进行了系统研究。表征研究显示，该纳米颗粒具有无定形性质，纳米材料基质中同时存在部分有序晶域，并保留姜黄素分子的单斜晶结构。合成的BNMs呈纳米级球形形貌、半结晶特征，且姜黄素、L-精氨酸和叶酸组分之间存在强分子间相互作用，证实生物杂化形成成功。生物学研究显示，与单用姜黄素相比，Cur-LA-FA BNMs具有显著更高的剂量依赖性抗癌活性。机制研究表明，Cur-LA-FA BNMs诱导TNBC细胞内ROS生成、线粒体膜去极化、caspase-3活性升高、Bax上调和Bcl-2下调，提示激活内源性线粒体凋亡通路。此外，FITC标记的Cur-LA-FA BNMs因与细胞表面FRs选择性结合，在MDA-MB-231细胞中表现出强烈细胞内绿色荧光。然而，尽管摄取数据支持FR介导靶向的作用，观察到的细胞毒效应不能完全归因于该机制，生物杂化纳米材料相关附加因素以及姜黄素的多重抗癌机制也可能参与总体抗癌活性。总体而言，这些结果表明Cur-LA-FA BNMs作为靶向三阴性乳腺癌细胞治疗的生物杂化纳米系统具有良好潜力。