猴痘病毒A29L与E8L蛋白对聚糖相互作用的表面等离子体共振分析及海洋来源聚糖的抑制作用研究

《Biosensors》：SPR Analysis of Monkeypox Proteins A29L and E8L Glycan Interaction and Inhibition by Marine-Derived Glycans

　　

猴痘的全球再度流行使得猴痘病毒（MPXV）（包含分支I和分支II）成为重大公共卫生威胁。对同源痘苗病毒蛋白的研究表明，细胞表面糖胺聚糖（GAG），包括硫酸乙酰肝素（HS）和硫酸软骨素（CS），可促进病毒附着和进入。然而，GAG与MPXV表面蛋白A29L/E8L之间的直接相互作用仍缺乏充分表征。研究人员采用表面等离子体共振（SPR）技术，定量了A29L（Clade I K_D = 0.8 ± 0.3 nM）和E8L（Clade I K_D = 1.2 ± 0.2 nM；Clade II K_D = 1.6 ± 0.1 nM）与肝素（一种常见的HS类似物）的表观结合亲和力。研究人员还定量了E8L与CS-A（Clade I K_D = 0.4 ± 0.2 nM；Clade II K_D = 0.65 ± 0.06 nM）和CS-E（Clade I K_D = 0.6 ± 0.1 nM；Clade II K_D = 0.70 ± 0.08 nM）的表观结合亲和力。研究人员进一步确定，Clade I A29L和E8L优先识别长链、完全硫酸化或N-硫酸化的肝素。最后，研究人员确定了一个小型的海洋来源硫酸化聚糖（MSG）文库可作为Clade I E8L和A29L蛋白-GAG界面的有效抑制剂。这些发现确立了此前未被表征的结合相互作用，并确定MSG是抗猴痘药物开发的潜在候选分子。

**猴痘病毒表面蛋白A29L/E8L与糖胺聚糖相互作用的SPR分析及海洋来源聚糖的抑制作用**

**1. 研究背景与科学问题**
猴痘（mpox）是由猴痘病毒（MPXV）引起的人畜共患传染病。MPXV属于痘病毒科正痘病毒属，其基因组为双链DNA，包含Clade I和Clade II两个分支。2022年Clade IIb引发的全球疫情促使世界卫生组织宣布其为国际关注的突发公共卫生事件；而2024年Clade Ib疫情的病死率接近10%，凸显了开发有效抗病毒药物的紧迫性。病毒表面蛋白与宿主细胞表面糖胺聚糖（GAG）的相互作用是病毒附着和进入的关键起始步骤。硫酸乙酰肝素（HS）和硫酸软骨素（CS）是细胞表面重要的GAG分子。同源痘苗病毒（VACV）的研究表明，其表面蛋白A27L和D8L分别与HS和CS结合，提示MPXV的同源蛋白A29L和E8L可能具有类似的聚糖结合特性。然而，针对MPXV不同分支（Clade I和Clade II）表面蛋白与不同GAG之间直接相互作用的研究仍然有限。为此，研究人员系统表征了MPXV A29L（Clade I）与E8L（Clade I和II）与肝素、CS-A和CS-E的直接结合能力，并进一步考察了海洋来源硫酸化聚糖（MSG）对上述蛋白-GAG界面的抑制作用。

**2. 研究内容与主要方法**
研究人员采用表面等离子体共振（SPR）技术，定量检测了重组A29L-His和E8L-His蛋白（购自Sino Biological，中国北京）与固定化GAG配体之间的结合动力学与亲和力。具体而言，SPR实验中使用了固定化生物素化肝素的链霉亲和素（SA）传感器芯片，以及固定化生物素化CS-A和CS-E的CM5传感器芯片（通过 Neutravidin 偶联）。结合数据采用1:1朗缪尔结合模型进行局部拟合，计算出表观解离常数（K_D）、结合速率常数（k_a）和解离速率常数（k_d）。此外，研究人员利用SPR竞争实验，评估了不同链长（dp4~dp20）的肝素寡糖、选择性脱硫酸肝素，以及包括岩藻糖基化硫酸软骨素（FucCS）和硫酸化岩藻聚糖（SF）在内的海洋源性硫酸化聚糖对蛋白-GAG结合的抑制效果。FucCS源自海参，SF源自海参及红藻和褐藻。

**3. 研究结果**

**3.1 SPR分析证明A29L/E8L与GAG存在强结合**
SPR结果显示，E8L Clade I和Clade II均以低纳摩尔表观亲和力结合CS-A（Clade I K_D = 0.4 ± 0.2 nM；Clade II K_D = 0.65 ± 0.06 nM）和CS-E（Clade I K_D = 0.64 ± 0.1 nM；Clade II K_D = 0.70 ± 0.08 nM）。Clade I与Clade II之间，以及CS-A与CS-E之间的结合亲和力均无显著差异。该结果表明VACV D8L的CS结合活性在MPXV E8L中保守，但E8L对CS-A和CS-E均表现出高亲和力，这与VACV D8L优先识别CS-E的特征不同。此外，研究人员首次报道E8L能够直接结合肝素，亲和力分别为Clade I K_D = 1.2 ± 0.2 nM和Clade II K_D = 1.6 ± 0.1 nM，提示E8L具有结合多种GAG的能力。A29L Clade I与肝素的表观亲和力为K_D = 0.8 ± 0.3 nM，且其结合和解离速率均慢于E8L，表明A29L与HS蛋白聚糖之间存在强相互作用。

**3.2 N-硫酸化和链长是A29L与E8L Clade I结合肝素的关键因素**
SPR竞争实验表明，dp4至dp20的肝素寡糖在5 μg/mL浓度下对A29L或E8L与固定化肝素的结合几乎没有抑制作用，而可溶性全长肝素则能显著抑制结合，表明两种蛋白均偏好长链肝素。在脱硫酸肝素竞争实验中，N-脱硫酸肝素对E8L结合的抑制率约35%，对A29L结合几乎无抑制；而2-O-脱硫酸和6-O-脱硫酸肝素表现出更强的抑制作用。完全硫酸化肝素可产生超过80%的抑制，证明N-硫酸基团及完整的硫酸基分布和密度对两种蛋白的聚糖识别至关重要。这些结果揭示了HS识别MPXV表面蛋白的特定结构需求。

**3.3 海洋来源硫酸化聚糖有效抑制MPXV蛋白-GAG相互作用**
研究人员进一步评估了MSG对A29L/E8L-肝素相互作用以及E8L-CS相互作用的抑制活性。在肝素竞争实验中，所有测试的MSG（包括HfSF、LvSF、IbSF及三种FucCS）在100 μg/mL浓度下均能抑制超过50%的A29L或E8L与肝素的结合，其中HfSF与IbSF的抑制作用最强。在CS-A和CS-E竞争实验中，FucCS（IbFucCS和HfFucCS）可将E8L结合降低约30%~40%，而PpFucCS的抑制率达60%~75%；硫酸化岩藻聚糖（SF）的抑制作用更为显著，几乎完全消除了E8L与CS-A和CS-E的结合。研究表明，MSG的强抑制效果可能与其高硫酸化修饰和电荷密度有关，而非单纯取决于单糖骨架的类型。这些发现表明MSG可作为体外有效的MPXV蛋白-GAG相互作用抑制剂。

**4. 结论**
本研究系统表征了MPXV表面蛋白A29L和E8L与CS及肝素的直接结合，明确了E8L对CS-A和CS-E的低纳摩尔亲和力，并首次发现E8L还具有结合肝素的能力，提示其具备更广泛的硫酸化聚糖识别潜力。A29L Clade I同样具有对肝素的纳摩尔级亲和力。竞争SPR实验进一步证明长链肝素和N-硫酸化修饰对两种蛋白的聚糖识别具有关键贡献。此外，海洋来源硫酸化聚糖在体外能有效抑制A29L/E8L与GAG的相互作用，为开发抗猴痘病毒附着与进入的抑制剂提供了有前景的候选分子。但上述化合物是否能在细胞水平或体内抑制MPXV的附着、进入和感染，仍需通过未来的细胞感染实验和病毒学研究加以验证。