含真空干燥 Ya Pra Sa Kra Tung Pew Pai Nok 提取物的局部喷雾制剂：GTG 标志物 HPLC-DAD 标准化、体外抗炎活性、6个月稳定性与人体斑贴安全性评价

《Pharmaceutics》：Characterization, Stability, and Safety Evaluation of a Topical Spray Formulation Containing Vacuum-Dried Ya Pra Sa Kra Tung Pew Pai Nok Extract

　　

摘要翻译：背景/目的：Ya Pra Sa Kra Tung Pew Pai Nok 是一种泰国传统药物配方，历史上用于发热及炎症性皮肤症状。本研究对一种含乳糖的真空干燥提取物进行表征，评价其体外抗炎活性，并将其加入局部喷雾制剂中。方法：该制剂由 Brachypterum scandens (Roxb.) Miq.、Tiliacora triandra (Colebr.) Diels. 和 Tamarindus indica L. 按等比例组成。选择染料木黄酮-7-O-[α-鼠李吡喃糖基-(1→6)]-β-吡喃葡萄糖苷（genistein-7-O-[α-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-glucopyranoside，GTG）作为化学标志物，并采用经方法学验证的高效液相色谱-二极管阵列检测法（HPLC-DAD）进行定量。结果：该方法在4–20 μg/mL范围内显示良好选择性和线性，日内和日间精密度相对标准偏差（RSD）分别为4.04%和3.43%，回收率为97.41–103.65%，检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.15和0.49 μg/mL。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）分析显示，含乳糖和不含乳糖的两种真空干燥提取物在所有测试浓度下均使RAW264.7细胞活力保持在80%以上。在非细胞毒性浓度下，含乳糖提取物显著降低脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7巨噬细胞中一氧化氮（NO）和前列腺素E₂（PGE₂）的产生，证明该提取物具有体外抗炎活性。选择含5% w/w干燥提取物的局部喷雾剂，其初始pH为4.43。在4、30和40 °C下储存6个月后，GTG剩余含量分别约为99.1%、92.9%和87.6%，表明存在温度依赖性降解。储存期间未检测到微生物污染。30名健康志愿者的人体闭合斑贴试验得出平均累积刺激指数（MCII）为0.05，表明在所测试条件下刺激可忽略。结论：这些发现支持将 Ya Pra Sa Kra Tung Pew Pai Nok 进一步开发为标准化的局部草药制剂。

皮肤炎症是多种皮肤病常见特征，局部炎症反应可致红斑、肿胀、刺激和不适；持续或过度炎症可破坏皮肤稳态并促进炎症性皮肤病进展。泰国传统草药长期用于炎症管理。Ya Pra Sa Kra Tung Pew Pai Nok 记载于Taxila药典，传统外用退热及治疗发热相关皮肤症状，由 Brachypterum scandens (Roxb.) Miq.、Tiliacora triandra (Colebr.) Diels. 和 Tamarindus indica L. 等比例组成。已有研究报道这些药材含异黄酮、黄酮、儿茶素、单宁、芦丁、酒石酸等具抗炎或抗氧化活性成分。传统制备以草药粉与硝酸钾、淘米水混合外用，但存在微生物污染、稳定性差、质量不一致和使用不便等问题，因此现代化为喷雾剂型具有优势。水性提取物制成干燥中间体便于处理、称量、标准化和重现性；真空干燥可在较低有效温度下除水，减少热暴露；因水提物固含量较低且干燥后可能粘稠，加入乳糖一水合物作为水溶性药物载体，主要作用为工艺性而非药理。GTG 为 B. scandens 来源异黄酮糖苷，选作标准化和稳定性评价的化学标志物，但研究人员认为其并非唯一活性成分，保留全标准化提取物更符合多药草特征。尽管有传统使用背景，其标准化干燥提取物、抗炎活性及稳定安全局部剂型证据仍有限，故开展本研究。

关键方法：三味药材等比例水提，加入5% w/w乳糖一水合物后55 °C、100 mbar真空干燥；建立HPLC-DAD法并以GTG为标志物定量；CCK-8法在RAW264.7细胞筛选非细胞毒性浓度，LPS刺激后以Griess法和ELISA测NO、PGE₂；制备1–10% w/w局部喷雾，选5% w/w进行4、30、40 °C六个月稳定性及微生物评价；30名20–65岁健康志愿者单盲闭合斑贴，按ICDRG评分计算MCII。植物材料购自泰国Nakhon Pathom的Charoensuk Pharma Supply Co., Ltd.，凭证标本SIRA 010–012存于Srinakharinwirot大学药学院；RAW264.7来自ATCC；人体研究经清迈大学药学院研究伦理委员会批准（002/2566/E）。

3.1 真空干燥含乳糖提取物的制备与得率：真空干燥液体提取物-乳糖混合物得粉率8.28% w/w；扣除乳糖后干燥草药提取物固体占终粉39.61% w/w，乳糖约60.39% w/w。乳糖高比例降低相对草药固体含量，比较总粉基化学组成或生物活性需考虑。5% w/w含乳糖干粉相当于约1.98% w/w实际草药提取物固体；GTG实测123.60 μg/100 mg干粉，按39.61%校正为约312.04 μg/100 mg等效草药提取物。

3.2 含乳糖真空干燥提取物中生物活性化合物的定量：HPLC显示干燥后保留主要成分；GTG标准保留时间27.5 min；提取物中piscidic acid、rutin、GTG分别在5.7、26.0、28.0 min，GTG为主要峰之一，适合作为质量控制与稳定性标志物。安慰剂无干扰，加标安慰剂及含提取物喷雾中GTG峰清晰。干粉GTG为123.60 μg/100 mg，校正后312.04 μg/100 mg等效提取物；研究人员选择全标准化提取物而非纯GTG。

3.3 HPLC方法验证：六次进样GTG保留时间约27.8 min，容量因子11.40，分离度2.05，拖尾因子1.18，理论板数约134,030；保留时间和峰面积RSD为0.13%和0.44%；峰纯度匹配998；4–20 μg/mL线性R²为0.998–1.000；日内和日间RSD为4.04%和3.43%；日间GTG为123.60 ± 4.24 μg/100 mg干提取物；提取物回收率97.41–103.65%，安慰剂喷雾94.37–100.34%；LOD和LOQ为0.15和0.49 μg/mL。

3.4 真空干燥含乳糖提取物在RAW264.7细胞中的细胞毒性评价：CCK-8显示两种真空干燥提取物在测试浓度均维持细胞活力>80%；无乳糖提取物0.0005–5 μg/mL活力约109.87 ± 7.38%至87.32 ± 8.23%；含乳糖提取物0.001–10 μg/mL活力约110.85 ± 2.26%至113.10 ± 21.88%；布洛芬50–800 μM呈浓度依赖降低，50–200 μM为非细胞毒，400和800 μM被排除。研究人员选择0.0005和0.005 μg/mL无乳糖提取物、0.001和0.01 μg/mL含乳糖提取物进一步评价抗炎活性，布洛芬50 μM为阳性对照。

3.5 真空干燥含乳糖提取物的抗炎活性：LPS 1 μg/mL刺激RAW264.7使亚硝酸盐升至47.25 ± 0.32 μM，未处理组为2.45 ± 0.71 μM；布洛芬50 μM降至5.87 ± 0.31 μM；含乳糖提取物0.001和0.01 μg/mL降至18.33 ± 7.09和12.52 ± 9.57 μM，抑制NO产生。PGE₂在LPS刺激后升至998.63 ± 112.37 pg/mL，布洛芬完全抑制；含乳糖提取物降至618.56 ± 53.66和606.02 ± 72.47 pg/mL；无乳糖提取物0.0005和0.005 μg/mL未降低PGE₂（1008.29 ± 57.00和910.58 ± 139.10 pg/mL）。讨论指出未直接测iNOS和COX-2，不能确认通路；含乳糖提取物PGE₂抑制强于无乳糖，但未按等效草药固体归一化且无乳糖-only对照，解释需谨慎。

3.6 载含乳糖真空干燥提取物的局部喷雾制剂特征：1–10% w/w喷雾均透明均一，无可见沉淀或相分离；颜色随浓度由浅黄至深棕；5% w/w为保持可接受透明度、均一性和可喷雾性的最高载量。5% w/w干粉含123.60 ± 4.24 μg GTG/100 mg，理论GTG为61.8 μg/g制剂；密度0.9937 ± 0.0108 g/mL，理论体积浓度61.41 μg/mL，约122.82 μg GTG/2 mL；初始pH 4.43 ± 0.01，近皮肤酸性。处方含5% w/w干粉、5%酒精USP、5%甘油、1%水溶性薄荷醇、0.5%苯氧乙醇和纯化水；研究人员称其为初步制剂可行性，未全面评价喷雾性能。

3.7 载含乳糖真空干燥提取物的局部喷雾制剂稳定性研究：在4、30、40 °C储存6个月。3.7.1 pH稳定性：初始pH 4.43 ± 0.01；4 °C为4.33–4.44，30 °C降至4.31，40 °C降至4.22，仍在局部皮肤产品可接受pH 4.0–6.0内，接近皮肤生理pH<5.0。3.7.2 化学稳定性与GTG降解动力学：实测初始GTG为157.89 ± 0.06 μg/2 mL并作为100%基线，比理论122.82 μg/2 mL高约28.6%；6个月剩余GTG在4、30、40 °C分别约99.1%、92.9%、87.6%，呈温度依赖；4 °C由157.89 ± 0.06降至156.46 ± 1.16 μg/2 mL，30 °C降至146.63 ± 1.16 μg/2 mL，40 °C降至138.32 ± 1.81 μg/2 mL。30和40 °C零级与一级模型均可描述，零级R²略高但无法明确区分；4 °C低R²为0.2955，动力学不可靠。Arrhenius理论t₉₀约4.76、0.75、0.36年（4、30、40 °C），仅为初步估计，不能用于确定货架期。3.7.3 微生物质量：6个月所有条件下TAMC、TYMC、S. aureus和P. aeruginosa均未检出；但未做防腐效能挑战试验，不能证明苯氧乙醇防腐体系有效性。

3.8 皮肤刺激性研究：30名健康志愿者（20女、10男；18–30岁23人，31–40岁7人）接受单盲闭合斑贴48 h；1% SLS阳性对照MCII为0.91，属中度刺激；DI水和空白制剂MCII为0，属非刺激；草药喷雾MCII为0.05，属非刺激/可忽略，未观察严重红斑、水肿或水疱，仅少数志愿者评分1。该研究未评价致敏、重复使用累积刺激、长期安全或受损皮肤。

讨论部分总结：乳糖高比例使总粉基比较需谨慎；GTG为标志物但非唯一活性成分；真空干燥可保留主要成分；体外抗炎活性可能与GTG及其他多酚成分有关，但NO/PGE₂通路未通过iNOS/COX-2直接评价确认；含乳糖提取物PGE₂抑制较强但未归一化且无乳糖对照，不能归因；稳定性呈温度依赖，4 °C保存较佳，但6个月观察和零级模型限制明显；微生物未污染但未验证防腐效能；斑贴仅单次48 h，不能评价致敏和累积刺激；最终喷雾的体内抗炎疗效未评价。

研究结论翻译：本研究确立GTG作为真空干燥 Ya Pra Sa Kra Tung Pew Pai Nok 提取物标准化和稳定性监测的合适标志物。该提取物显示良好细胞相容性，并通过降低LPS刺激RAW264.7巨噬细胞中NO和PGE₂产生表现体外抗炎活性。5% w/w局部喷雾具有可接受理化性质和微生物质量，在健康志愿者单次闭合斑贴试验条件下产生可忽略刺激。局部喷雾中GTG稳定性呈温度依赖性，4 °C保存更佳。最终局部喷雾的抗炎疗效未在体内评价。这些发现支持该制剂的进一步开发，同时需要更长周期稳定性、皮肤递送和疗效研究以确定货架期和治疗性能。