《Cell》：Perforin triggers iron-induced mitochondrial damage to drive ferroptosis and anti-tumor immunity
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细胞毒性CD8+ T细胞与自然杀伤（natural killer, NK）细胞是抗肿瘤免疫的关键效应细胞。细胞毒性淋巴细胞通过释放穿孔素（perforin, Prf1）这一成孔蛋白清除肿瘤细胞，使颗粒酶（granzymes, Gzms）进入靶细胞并触发半胱天冬
细胞毒性CD8+ T细胞与自然杀伤（natural killer, NK）细胞是抗肿瘤免疫的关键效应细胞。细胞毒性淋巴细胞通过释放穿孔素（perforin, Prf1）这一成孔蛋白清除肿瘤细胞，使颗粒酶（granzymes, Gzms）进入靶细胞并触发半胱天冬酶依赖与非依赖的细胞死亡。本研究揭示Prf1此前未被认识的、不依赖Gzm的功能。研究人员发现Prf1直接诱导肿瘤细胞的铁死亡（ferroptosis），即一种铁依赖与脂质依赖的调控性细胞死亡形式。机制上，Prf1介导的成孔驱动转铁蛋白受体（transferrin receptor, TFR/CD71）的内吞，增强细胞铁摄取；Prf1促进内体-线粒体接触形成，导致线粒体铁蓄积、线粒体功能障碍与肿瘤细胞铁死亡。在小鼠肿瘤模型中，膳食铁补充以Prf1依赖方式抑制肿瘤进展。在癌症患者样本中，较高Prf1表达与更好生存及增强的免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）应答相关。这些发现界定了Prf1作为通过铁死亡直接执行癌细胞死亡的不依赖Gzm功能。
研究背景与立项依据
细胞毒性CD8+ T细胞（CTL）与自然杀伤（NK）细胞是抗肿瘤免疫的核心效应细胞，传统认知中，穿孔素（Prf1）仅作为成孔蛋白协助颗粒酶（Gzm）进入靶细胞，触发凋亡等死亡程序。然而，临床与动物研究提示部分高表达Prf1的杀伤细胞几乎不表达Gzm A/B，且Gzm缺陷模型仍保留肿瘤排斥能力，说明Prf1可能存在独立于Gzm的杀瘤机制。与此同时，铁死亡（ferroptosis）作为一种铁依赖的脂质过氧化驱动死亡方式，已被证实参与肿瘤免疫应答，但其执行者长期不明。该研究正是为回答“Prf1是否可不依赖Gzm直接驱动肿瘤铁死亡”这一关键科学问题而开展，论文发表于《Cell》。
主要技术方法概述
研究人员整合了人癌单细胞测序队列（结直肠癌、黑色素瘤、三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌）与小鼠肿瘤模型（MC38、YUMM5.2、B16-F10等），结合Prf1敲除（Prf1?/?）与Gzm A/B双敲除（GzmA/B?/?）遗传模型、重组亚溶胞Prf1处理、NK/T细胞共培养、铁死亡抑制剂干预、膳食铁补充联合免疫检查点阻断（ICB）实验；利用流式探针（FerroOrange、MitoFerroGreen、BODIPY C11）检测胞内与线粒体铁及脂质过氧化，借助Airyscan共聚焦与电镜解析内体-线粒体接触，并通过ICP-MS关联人结肠癌组织Prf1转录与铁含量。
研究结果
Prf1是有效抗肿瘤免疫所必需
研究人员分析发现，人及小鼠肿瘤微环境中存在大量仅表达Prf1而不表达Gzm A/B的T/NK细胞。泛癌RNA测序中高Prf1表达预示更好生存，ICB治疗应答者Prf1更高；Prf1/GzmB比值高与病理完全缓解相关。体外YT-INDY NK缺失Prf1后杀瘤能力丧失，而GzmB缺失不影响；体内Prf1?/?小鼠在多种肿瘤模型中进展更快，且CD8或NK耗竭不再额外加剧，证明Prf1具有不依赖Gzm的必需抗肿瘤功能。
Prf1介导肿瘤细胞铁死亡
使用亚溶胞剂量Prf1处理HT1080、HCT116、HeLa等细胞，坏死、凋亡、焦亡抑制剂均不能挽救死亡，而铁螯合剂（去铁酮DFO、地拉罗司DFX）及铁死亡抑制剂（ferrostatin、liproxstatin-1）完全阻断。Prf1升高活性氧（ROS）、脂质过氧化（BODIPY C11、4-HNE）并富集铁死亡基因特征；与GPX4抑制剂RSL3协同，且IFN-γ仅增敏不替代Prf1作用。
铁改善抗肿瘤免疫反应
标准饮食添加3000 ppm铁可降低野生鼠MC38/YUMM5.2肿瘤负荷，但在NSG免疫缺陷鼠与Prf1?/?鼠中失效；liproxstatin抵消铁益处。高铁饮食增加肿瘤氧化脂质与CD8+ T细胞IFN-γ、TNF-α功能，并与抗PD-L1治疗协同，说明铁通过Prf1-铁死亡轴增强免疫。
Prf1经转铁蛋白受体内吞诱导铁死亡
Prf1在37℃而非4℃提升胞内铁，成孔突变体无此效。内吞抑制（dynasore、甲基-β-环糊精）阻断死亡；Prf1降低表面CD71、促进转铁蛋白摄取，holo-TF增强致死，TFR或DMT1抑制/敲除均减弱铁蓄积与死亡，证明铁经TFR内吞通路进入。
Prf1增加线粒体铁并破坏其功能
Prf1降低线粒体膜电位，升高线粒体超氧与脂质ROS，线粒体铁探针显示铁蓄积；线粒体铁螯合剂NarAM23与靶向抗氧化剂mitoquinone均可挽救死亡。Prf1缺失NK细胞无法诱导靶细胞线粒体铁上升。
Prf1增加内体-线粒体互作位点
三维成像与电镜显示，Prf1诱导“甜甜圈”线粒体、巨大内体及内体-线粒体物理接触增多，活细胞成像见转铁蛋白内体向线粒体转运增强，形成“内吞-接触-铁转移”模型；人结肠癌组织Prf1转录水平与ICP-MS测得铁含量正相关。
讨论与结论翻译
讨论指出，该研究揭示细胞毒性淋巴细胞清除肿瘤的新机制：Prf1不依赖Gzm直接触发铁死亡。Prf1成孔驱动CD71内吞，促进载铁内体与线粒体接触，使铁转入线粒体引发氧化应激与功能崩溃。Prf1与IFN-γ协同但可独立作用。相比凋亡保留膜完整性，铁死亡造成不可逆膜损伤，或可绕过免疫抑制微环境中吞噬清除障碍并增强树突状细胞交叉呈递免疫原性。膳食铁是可调控变量，对ICB有潜在增敏价值，但铁在促瘤与抑瘤间的情境依赖需进一步厘清。
研究结论：研究人员界定了Prf1的一种不依赖Gzm的功能，即作为通过铁死亡直接执行癌细胞死亡的效应分子；该机制由线粒体铁蓄积与磷脂氧化标志，区别于经典凋亡，为克服肿瘤免疫耐受提供了新靶点。
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