《Nutrients》：Niacin and B. animalis subsp. lactis F1-7 Additively Attenuate Alcohol-Induced Liver Injury in a Gut Microbiota-Dependent Manner via the HCAR2-NLRP3 Pathway
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目的：本研究探讨了烟酸与动物双歧杆菌乳亚种F1-7联合给药是否通过肠-肝轴对酒精诱导的肝损伤发挥保护作用，特别聚焦于HCAR2-NLRP3信号通路，并进一步研究了肠道菌群及其代谢物的功能角色。方法：通过Lieber–DeCarli液体饲料慢性乙醇喂养建立小鼠酒
目的：本研究探讨了烟酸与动物双歧杆菌乳亚种F1-7联合给药是否通过肠-肝轴对酒精诱导的肝损伤发挥保护作用，特别聚焦于HCAR2-NLRP3信号通路，并进一步研究了肠道菌群及其代谢物的功能角色。方法：通过Lieber–DeCarli液体饲料慢性乙醇喂养建立小鼠酒精性脂肪肝模型。实验动物被分为六个干预组：对照组、模型组、单独烟酸组、单独F1-7组、烟酸与F1-7联合组（NF），以及抗生素预处理后接受NF干预组（NF-ABX）。结果：NF干预显著改善血清脂质，降低ALT/AST水平，缓解肝脏脂肪变性和炎症，恢复肠道屏障完整性，同时上调HCAR2并抑制NLRP3激活；这些效应在抗生素处理后基本消失。16S rRNA测序显示，NF干预重塑了肠道菌群，富集了有益菌属如乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和粪杆菌属（Faecalibaculum）。非靶向代谢组学表明，NF干预富集了酮体β-羟基丁酸（β-hydroxybutyrate），其与有益菌丰度呈正相关；该代谢物被鉴定为酮体合成/降解通路中的关键节点，并在VIP评分中位列前茅。结论：该组合通过肠道菌群依赖的方式协同减轻酒精诱导的肝脏和肠道损伤。联合干预后，肠道β-羟基丁酸以菌群依赖的方式富集，且该富集与HCAR2激活和NLRP3抑制相关联。这些发现表明，这种保护作用很大程度上依赖于完整的肠道菌群，并为该联合干预作为对抗酒精性肝病的一种有前景的策略提供了支持。
一、研究背景
酒精性肝病（alcoholic liver disease, ALD）是由长期过量饮酒引起的肝脏疾病。流行病学数据显示，全球约23亿人饮用酒精饮料，其中超过9.5亿人存在过度饮酒模式。在酒精代谢过程中，其代谢产物会诱导肝细胞产生炎性细胞因子和氧化应激，最终导致肝细胞结构和功能的损伤。尽管ALD临床负担沉重，但目前针对肠-肝轴的安全有效干预措施仍然有限，现有治疗主要依赖戒酒和支持性护理。肠道屏障、肠道菌群及其代谢物被认为是ALD中肝脏炎症的关键调节因子，然而特定的营养成分和益生菌菌株能否通过菌群依赖机制协同减轻酒精性肝损伤尚不完全清楚。烟酸（维生素B3或烟酸）是水溶性必需营养素，可作为羟基羧酸受体2（hydroxycarboxylic acid receptor 2, HCAR2）的强效配体。已有研究表明，烟酸补充可改善酒精诱导的肠道屏障损伤和肝脏炎症，重塑肠道菌群，增加结肠乳杆菌丰度并促进代谢物丁酸盐的产生。益生菌已被证明可通过改善消化和免疫功能对整个机体产生有益影响。研究人员前期工作鉴定了动物双歧杆菌乳亚种F1-7这一菌株，其在维持末端回肠和结肠微生物群落结构以及发挥抗炎和降脂作用方面发挥重要作用。尽管烟酸和益生菌各自在ALD中显示出潜力，但其组合是否通过菌群依赖机制产生附加保护作用，以及哪种特定微生物代谢物介导了这种效应，仍是未知的。
二、研究内容和结论
为填补上述空白，本研究利用慢性酒精喂养8周的小鼠模型模拟酒精性肝损伤，评估烟酸和动物双歧杆菌乳亚种F1-7联合干预的抗炎效果，并探究其是否通过菌群依赖的代谢物-HCAR2途径发挥作用。研究人员将SPF级雄性C57BL/6小鼠随机分为六组：对照组（Control）、酒精性脂肪肝模型组（AFLD）、烟酸组（NA）、F1-7组、烟酸+F1-7联合组（NF）以及抗生素+烟酸+F1-7组（NF-ABX）。研究结果表明，烟酸与动物双歧杆菌乳亚种F1-7的联合给药有效改善了酒精诱导的肝脏脂肪变性和肝功能损伤，纠正了血清脂质代谢紊乱，并恢复了肠道屏障完整性，其效果优于任一单一干预。其潜在机制与上调HCAR2和抑制NLRP3炎症小体激活有关。这些保护作用在很大程度上依赖于完整的肠道菌群。此外，联合干预以菌群依赖的方式富集了肠道β-羟基丁酸，该富集与HCAR2激活相关。这一发现揭示了肠道菌群衍生分子对宿主代谢控制的贡献，为开发旨在减轻酒精相关肝损伤的功能性组合产品提供了概念基础。
三、主要关键技术方法
- 1.
动物模型建立：采用Lieber–DeCarli液体饲料对8周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠进行为期8周的慢性乙醇喂养，建立酒精性脂肪肝小鼠模型。
- 2.
16S rRNA微生物多样性测序分析：提取肠道内容物总DNA，扩增V3-V4高变区，在Illumina NovaSeq PE250平台进行双端测序，由上海美吉生物医药科技有限公司完成。
- 3.
非靶向代谢组学分析：使用超高效液相色谱-轨道阱Exploris 240质谱系统（Thermo Scientific UHPLC-Orbitrap Exploris 240）对肠道内容物进行LC-MS/MS分析，数据处理基于HMDB、Metlin及自建Majorbio数据库。
- 4.
组织病理学检测：通过苏木精-伊红染色和油红O染色评估肝脏病理改变和中性脂质积累。
- 5.
免疫组化和免疫荧光检测：分别用于评估肠道黏膜屏障蛋白（ZO-1、claudin-1、occludin）表达以及肝脏和肠道组织中HCAR2蛋白丰度。
- 6.
分子生物学检测：采用RT-qPCR检测肝脏和肠道炎症相关基因（NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β）mRNA表达；Western blot检测肝脏NLRP3、Caspase-1及Caspase-1 p20蛋白水平。
四、研究结果
3.1 烟酸联合动物双歧杆菌乳亚种F1-7对小鼠脂质代谢的影响
通过测定血清脂质水平发现，与AFLD组相比，NF组的总胆固醇（TC）和三酰甘油（TG）分别下降61.69%和57.79%，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）升高而低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）降低，效果显著优于单药组。抗生素处理后（NF-ABX组），血脂改善效果明显减弱，表明联合干预的降脂作用依赖于完整肠道菌群。肝脏组织学观察显示，NF组肝索排列相对整齐，脂滴空泡和炎性浸润最轻，而NF-ABX组仍可见较多脂滴空泡。
3.2 烟酸联合动物双歧杆菌乳亚种F1-7对小鼠炎症反应的影响
与AFLD组相比，NF组血清脂多糖（LPS）下降66.49%，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-18（IL-18）分别下降60.34%、69.25%和60.35%，均优于单药组的41-45%降幅。NF-ABX组上述指标仅下降≤30%。肝脏丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）活性在NF组分别降低61.74%和52.58%，而NF-ABX组仅降低27.85%和20.42%。
3.3 烟酸联合动物双歧杆菌乳亚种F1-7对小鼠关键炎症靶点的调控作用
RT-qPCR显示，NF组肝脏NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β mRNA表达较AFLD组分别降低48.58%、54.96%、52.17%和63.77%，NF-ABX组仅降低19.45%-26.69%。免疫荧光显示NF组肝脏和肠道HCAR2蛋白水平升高最显著，NF-ABX组无明显变化。Western blot证实NF组NLRP3、Caspase-1和Caspase-1 p20蛋白水平降低最为显著，NF-ABX组改善最小。
3.4 烟酸联合动物双歧杆菌乳亚种F1-7对小鼠肠道通透性的影响
免疫组化显示，AFLD组紧密连接蛋白ZO-1、claudin-1和occludin表达显著降低。NF组表现出最显著的恢复效果，claudin-1和occludin水平显著高于其他干预组。NF-ABX组三种标志物均无明显改善，表明菌群耗竭基本消除了屏障保护效应。
3.5 烟酸联合动物双歧杆菌乳亚种F1-7对小鼠肠道HCAR2/NLRP3/Caspase-1通路的调控作用
免疫荧光显示NF组肠道HCAR2蛋白上调最显著。免疫组化显示NF组NLRP3阳性面积在所有干预组中最低。NF组肠道ASC和Caspase-1 mRNA分别降低52.79%和49.64%，而NF-ABX组仅降低23.23%和24.71%。
3.6 烟酸联合动物双歧杆菌乳亚种F1-7对小鼠肠道菌群的影响
16S rRNA测序显示，酒精暴露显著降低了物种丰富度指数（Ace和Chao）。NF组Ace和Chao值与对照组无差异，表明部分恢复了菌群丰富度。NF-ABX组α多样性显著降低。门水平上，NF组显著富集了拟杆菌门（Bacteroidota）。属水平上，NF组增加了乳杆菌属（Lactobacillus）、粪杆菌属（Faecalibaculum）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）等有益菌丰度。Spearman相关性分析显示，这些有益菌与HDL-C正相关，与大多数脂质、肝损伤和炎症标志物负相关。
3.7 烟酸联合动物双歧杆菌乳亚种F1-7对小鼠肠道代谢物的影响
非靶向代谢组学PLS-DA模型显示NF组与AFLD组代谢谱明显分离。与AFLD组相比，NF组有1101个显著改变的代谢物。KEGG通路富集分析显示酮体合成/降解通路显著改变，其中核心代谢物β-羟基丁酸在NF组显著升高且在VIP评分中排名第三。NF-ABX组β-羟基丁酸相对丰度呈显著下降趋势。Spearman相关性分析显示，β-羟基丁酸与阿克曼氏菌属（Akkermansia）和乳杆菌属等有益菌呈显著正相关，与罗姆布茨菌属（Romboutsia）等潜在致病菌呈显著负相关。
五、讨论与结论
研究人员在讨论中指出，ALD的病理过程包括酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化，严重影响患者生活质量。本研究证实，烟酸和动物双歧杆菌乳亚种F1-7联合给药显著抑制了循环ALT和AST活性，减轻了肝脏炎性浸润和脂滴沉积。HCAR2表达升高而NLRP3表达降低，这与HCAR2信号通过限制NF-κB核转位来阻碍NLRP3炎症小体启动和组装的已知机制一致。值得注意的是，抗生素耗竭肠道菌群后，NF对肝脏和肠道炎症的改善作用几乎消失，表明肠道微生物群对观察到的保护作用至关重要。关于肠道屏障，NF方案对ZO-1、claudin-1和occludin的恢复效果显著优于任一单药，体现了协同效应。非靶向代谢组学揭示NF组改变了酒精破坏的肠道代谢谱，酮体代谢显著改变，涉及β-羟基丁酸。作为HCAR2的内源性配体，β-羟基丁酸可通过结合结肠上皮和免疫细胞上的HCAR2发挥抗炎作用。研究人员也承认了研究的局限性：NF-ABX组的结果只能证明完整肠道菌群是关键因素，但无法识别具体微生物介质；β-羟基丁酸-HCAR2-NLRP3机制的因果关系需进一步通过HCAR2缺陷小鼠、靶向代谢物补充和粪菌移植等实验验证。
研究结论：本研究建立了酒精诱导肝损伤小鼠模型，评估了烟酸、动物双歧杆菌乳亚种F1-7及抗生素介导的肠道菌群耗竭的效果。结果表明，烟酸和动物双歧杆菌乳亚种F1-7联合给药有效改善了酒精诱导的肝脏脂肪变性和肝功能损伤，纠正了血清脂质代谢紊乱，恢复了肠道屏障完整性，效果优于任一单一干预。其潜在机制与上调HCAR2和抑制NLRP3炎症小体激活有关。这些保护作用很大程度上依赖于肠道菌群。此外，联合干预以菌群依赖的方式富集了肠道β-羟基丁酸，该富集与HCAR2激活相关。该β-羟基丁酸源于微生物还是宿主，以及是否因果性地介导了HCAR2通路，有待进一步研究。
