香港牡蛎软组织内源性肽制剂调控人肠上皮细胞骨架基因表达程序的研究

《Foods》：An Endogenous Peptide Preparation from Oyster Soft Tissues Modulates the Cytoskeletal Gene Expression Programme of Human Intestinal Epithelial Cells

　　

香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）通常被生食且整只食用，因此其组织所携带的内源性肽未经加工即可到达肠道管腔；针对食物来源肽的功能研究一直集中于阳离子序列。本研究探讨了该物种的内源性肽群体是否偏向阴离子性，以及该群体的制剂是否改变人肠上皮细胞的细胞骨架基因程序。研究人员重新分析了该物种已发表的血浆肽组学数据（PXD025247），在不添加任何蛋白酶的条件下从牡蛎软组织中制备了低于10 kDa的内源性肽组分，并将该制剂以0.1–2.0 mg/mL的浓度作用于分化的人结直肠腺癌细胞（Caco-2）单层6–24 h；以载体对照、蛋白酶消化对照及仅消化对照为参照，通过定量PCR检测了九个转录本的表达。在333条肽中，157条（47.1%）在pH 7时携带?1或更低的净电荷，148条（44.4%）接近中性，28条（8.4%）携带+2或以上电荷，且在所有四个检测分层中阴离子肽均多于阳离子肽（36.4%–58.3%对4.8%–9.1%）。肌动蛋白家族蛋白是最大的前体来源（186条肽，占55.9%；对肌动蛋白的覆盖率为68.3%）。该制剂以2.41 ± 0.23 mg/g湿组织回收，在2.0 mg/mL浓度下，血清反应因子（SRF）靶基因CCN1（2.91倍）、VIL1（2.29倍）、MYH9（2.17倍）和ACTN1（1.83倍）的转录水平均显著升高（各p < 0.01），TMSB4X、CFL1和PFN1也分别升高1.90、1.75和1.55倍（q < 0.05），而SRF和MRTFA转录本不变；蛋白酶K消化可消除该反应。因此，来自牡蛎软组织的内源性肽制剂作用于人肠上皮细胞的细胞骨架基因程序，而该肽组学中偏向阴离子的多数群体正是值得直接进行功能表征的部分。

论文解读

一、研究背景与科学问题

肠道上皮是膳食蛋白及其衍生肽最先接触的宿主腔室，也是饮食来源肽类启动宿主效应的界面。单层肠上皮兼具选择性通透屏障与主动感知系统的功能，其对管腔内容物的响应涉及编码连接复合体和细胞骨架组分的基因协调转录。以往对食物来源肽的研究几乎全部集中于水解产物——即通过外加蛋白酶裂解肽键所得的群体，其组成由所选酶的底物特异性决定，而非由食物本身决定。牡蛎在许多沿海地区被生食且整只食用，其软组织在摄入前不经过任何加工步骤，因此组织自身蛋白水解系统所产生的内源性肽可以完整地到达肠道管腔。然而，此前尚无研究将牡蛎组织的内源性非水解肽群体与肠上皮基因程序进行直接关联测试。

该领域在选择研究对象时长期偏向短阳离子序列。阳离子和两亲性肽是经典抗菌化学型，可通过阳离子交换层析从水解物中高效富集，也是抗菌肽数据库系统收集的对象。但对除直接杀灭细菌以外的活性而言，这一偏好缺乏充分依据。研究人员重新分析已发表的香港牡蛎血浆肽组学数据后发现，333条肽中有157条（47.1%）在pH 7时携带?1或更低净电荷，仅28条（8.4%）携带+2或以上电荷。原始研究仅选择了六条上调的高阳离子肽进行抗菌测试，即现有功能数据仅描述了占8.4%的阳离子少数群体。阴离子多数群体在组成上是构成性的——中位含三个酸性残基、占长度的13.6%、74.2%具有负疏水性——且不随动物生理状态改变。因此，阴离子偏斜是该肽组学的固有属性，而这一未被功能研究触及的群体正是本研究的出发点。

肌动蛋白家族蛋白是该肽组学最大的单一前体来源，两条独立的证据链使上皮细胞骨架成为此类肽群体的合理首要靶标。其一，肽可直接作用于肌动蛋白系统：趋化肽在数秒内改变中性粒细胞的F-肌动蛋白含量及分布，富含脯氨酸的短基序可结合肌动蛋白成核调节因子，肌动蛋白衍生肽可通过肌动蛋白结合蛋白调节细胞骨架相关活动。其二，上皮细胞骨架是受转录调控的结构，连接蛋白、绒毛蛋白基顶端结构、肌球蛋白II收缩性和肌动蛋白交联蛋白均属于在炎症、修复和上皮可塑性过程中被重塑的基因程序产物。肌动蛋白单体结合蛋白中，丝切蛋白-1调节肠道连接完整性和黏膜炎症，profilin-1和胸腺素β4控制供给丝状肌动蛋白组装的单体库。

读取肌动蛋白动力学的转录节点是心肌蛋白相关转录因子-血清反应因子（MRTF–SRF）轴。单体肌动蛋白将MRTF辅因子滞留于胞质；当丝状体与单体平衡发生偏移时，MRTF进入细胞核并激活SRF依赖性基因，包括肌动蛋白本身、非肌球蛋白重链、α-辅助动蛋白、绒毛蛋白和即刻早期基质细胞蛋白CCN1。该轴在肠上皮中发挥作用，MRTF-A剂量控制稳态更新，其读出是转录层面的而非翻译后层面的，因为调控发生在辅因子定位水平而非SRF丰度水平。

二、研究目的与开展的研究

本研究提出并检验了两个假设：第一，该物种的内源性肽群体存在阴离子偏斜，且该偏斜是肽组学的构成性属性而非挑战响应亚群的特性；第二，该群体的制剂可改变分化的人肠上皮细胞中SRF依赖性细胞骨架基因程序的转录。为此，研究人员重新分析了已发表的香港牡蛎血浆肽组学数据以定义电荷分布和前体来源，并在不添加任何蛋白酶的条件下从牡蛎软组织中制备内源性肽组分，将其以0.1–2.0 mg/mL的浓度作用于分化的人肠上皮Caco-2单层6–24 h，测量构成SRF依赖性细胞骨架程序的九个转录本以及编码肌动蛋白单体结合蛋白和通路核心的转录本。蛋白酶K消化制剂和仅消化对照确立了反应的肽依赖性。

三、主要关键技术方法

研究人员重新分析了ProteomeXchange数据集PXD025247中已发表的香港牡蛎血浆肽组学数据，未进行新的质谱分析。牡蛎（Crassostrea hongkongensis）采自中国茂名商业贝类养殖场，三个独立制备各来自20只动物的独立采集批次。内源性肽组分的制备采用组织匀浆、离心、0.45 μm膜过滤、10 kDa超滤截留、3 kDa装置脱盐、冻干复溶的流程，全程不添加任何外源蛋白酶。细胞实验使用ATCC HTB-37 Caco-2细胞系（第25–35代），在Transwell插入件上分化21天，以跨上皮电阻（TEER）确认屏障形成。处理包括肽制剂三个浓度（0.1、0.5、2.0 mg/mL）三个时间点（6、12、24 h），并设置载体对照、蛋白酶K消化对照和仅消化对照。RNA提取后以SYBR Green定量PCR检测九个目标转录本，以geNorm评估参考基因稳定性，选用B2M和HPRT1为参考基因。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）加Dunnett检验处理预设主要终点，Benjamini–Hochberg校正处理次要终点家族。

四、研究结果

4.1 牡蛎血浆肽组学的电荷分布特征

重新分析PXD025247肽表发现344条条目，去除反库命中后余338条，再去除5条污染库匹配后得到333条分析集。肽段长度为8–40个残基（中位18），质量为0.93–4.38 kDa（中位1.95 kDa）。电荷分布强烈不对称：pH 7中位净电荷为?0.9，157条（47.1%）携带?1或更低净电荷，148条（44.4%）介于?1和+2之间，28条（8.4%）携带+2或以上。酸性特征具有组成性：中位肽含三个酸性残基、占长度的13.6%，74.2%的肽具有负GRAVY值。阴离子肽约占群体一半，而作为功能研究对象的阳离子亚群不足十分之一。

4.2 各检测分层的电荷分布

333条肽分为四个互斥分层：仅未挑战样本检出11条、仅挑战后检出265条、两者均检出21条、六个运行中均无非零强度36条。四个分层中阴离子比例分别为36.4%、46.0%、47.6%和58.3%，阳离子比例为9.1%、9.1%、4.8%和5.6%；中位净电荷分别为0、?0.8、?0.9和?1.0。阴离子肽在每个分层中均至少以四倍优势超过阳离子肽。挑战响应亚群的大小本身依赖判据，在十五种判据组合下从13到185条不等，因此研究采用不依赖阈值选择的整体群体和分层亚群进行组成分析。

4.3 肽组学的前体来源

在数据集附带的17,609条蛋白条目中搜索含肌动蛋白特征基序DNGSGMCKAGFAGDDAPR的350–400残基序列，鉴定出五个肌动蛋白家族条目。在三种计数规则下，159条肽（47.7%）以EVMG003590.1为前导蛋白，186条肽（55.9%）归属于肌动蛋白家族。肌动蛋白家族蛋白是最大的单一前体来源。186条肌动蛋白家族肽覆盖EVMG003590.1的360个残基中的246个（68.3%），最大覆盖深度为48条肽，除139–221位之间的83残基缺口外覆盖连续。肌动蛋白前体贡献依赖生理状态：仅未挑战检出层为36.4%，仅挑战后检出层为63.0%，两者均检出层为14.3%，无强度层为33.3%。肌动蛋白优势是挑战重塑肽组学的属性，而阴离子电荷分布是整体肽组学的属性。

4.4 阴离子与阳离子亚群的组成比较

阴离子肽（净电荷≤?1，n=157）比阳离子肽（≥+2，n=28）更短，中位长度分别为16和22.5个残基（p=0.0066），中位质量分别为1778和2434 Da（p=0.0048）。阴离子肽的酸性残基比例更高（长度占比18.2%对8.5%，p=3.0×10??），碱性残基更少（中位2个对4个，p=7.4×10?1?）。两亚群在疏水性上无差异（中位GRAVY ?0.31对?0.51，p=0.93），在前体来源上也无差异（肌动蛋白家族占阴离子亚群54.1%、阳离子亚群57.1%，p=0.84）。电荷按长度和酸性残基含量划分该肽组学，而非按前体蛋白家族划分。

4.5 组织制剂的尺寸类别与产量

分析集中所有肽均低于10 kDa截留阈值：最大为4.38 kDa，333条中292条（87.7%）低于3 kDa。三个独立制备的总肽产量为2.41 ± 0.23 mg/g湿组织，批间变异系数为9.4%。<3 kDa和3–10 kDa组分分别占回收肽的71.2 ± 2.3%和28.8%。残余蛋白为18.9–26.8 μg/mg肽，内毒素含量为0.038–0.061 EU/mg。

4.6 SRF靶基因的浓度-反应关系

单层在汇合后第21天TEER超过350 Ω·cm2后进行处理。暴露于肽制剂后，四个预设主要终点基因均呈浓度依赖性变化。在2.0 mg/mL浓度下，CCN1表达升高2.91倍（p=0.0014），VIL1升高2.29倍（p=0.0001），MYH9升高2.17倍（p<0.0001），ACTN1升高1.83倍（p=0.0083），四个终点均达显著。在0.5 mg/mL下增幅较小（分别为1.99、1.68、1.49和1.47倍），VIL1（p=0.0111）和MYH9（p=0.0289）达显著，CCN1处于边缘（p=0.0532）。0.1 mg/mL下所有转录本均与载体无差异。反应在6 h即出现且24 h未衰减。最高浓度下细胞活力保持在92%以上。

4.7 肌动蛋白单体结合转录本与通路核心

在2.0 mg/mL下，TMSB4X升高1.90倍（p<0.0001，q<0.0001），CFL1升高1.75倍（p=0.0003，q=0.0007），PFN1升高1.55倍（p=0.0062，q=0.0103），三者经Benjamini–Hochberg校正后仍显著。MRTFA小幅升高但未达显著（1.31倍，p=0.4251），SRF转录本不变（1.07倍，p=0.9405）。七个转录本同向移动，CCN1反应最强（2.91倍），结构性SRF靶基因VIL1和MYH9次之（2.29和2.17倍），TMSB4X、ACTN1、CFL1和PFN1共同处于1.55–1.90倍范围。

4.8 反应的肽依赖性

蛋白酶K预消化制剂消除了MYH9、ACTN1、VIL1和CCN1表达的变化。蛋白酶处理组与载体无差异（分别为1.04、0.98、1.06和1.02倍；p>0.05），含热灭活蛋白酶K的仅消化对照也与载体无差异（p>0.05）。载体经过了相同的超滤、脱盐和冻干流程，仅消化对照排除了酶或其热灭活产物的效应。

五、讨论总结与结论翻译

讨论部分总结： 本研究报道了两个相互关联的发现。第一，该物种的内源性肽群体呈阴离子偏斜，且该偏斜不随动物生理状态改变。第二，不含外加蛋白酶的内源性肽制剂改变了分化人肠上皮细胞的细胞骨架基因程序。该领域以往集中于阳离子和两亲性序列，原因部分出于化学、部分出于技术——阳离子肽是经典抗菌化学型、被数据库系统收集、且易于通过阳离子交换从水解物中富集。本研究量化了这一偏好在该物种中的代价：已被表征的阳离子亚群仅占肽组学的8.4%，而携带?1或更低净电荷的47.1%从未被测试。阴离子肽在直接杀菌以外的多个场景中具有活性，且阴离子特性决定肠道管腔行为——低等电点肽抵抗肠道阴离子内肽酶的优势消化并在酸性pH下保持完整，有利于其存活至上皮表面。与既往牡蛎肽研究的比较在三个方面具有启发性：起始材料不同（既往为外加蛋白酶水解物或全组织水提物）；生物学终点不同（既往为炎症或氧化还原相关终点，本研究为细胞骨架基因程序）；同样的逻辑已成功应用于其他食物来源肽的肠道研究。反应的量级和模式携带机制信息：CCN1作为需要MRTF和SRF活性的即刻早期SRF靶基因在每个浓度下反应最强，结构性SRF靶基因次之，肌动蛋白单体结合蛋白转录本处于同一范围，通路核心反应最弱——SRF和MRTFA转录本不变而七个下游转录本同向移动，这是转录因子-靶基因关系的特征性签名，将通路调控定位于辅因子易位水平而非转录本丰度水平。变化模式与通过MRTF–SRF信号传导作用于肌动蛋白动力学一致，三个单体结合转录本的同时上升提示单体库为可能的作用位点。食品相关性方面，牡蛎在许多沿海地区被生食整只食用，实测产量2.41 mg肽/g湿软组织确立了可食用部分内源性肽库的规模；血浆肽组学定义了该物种自身蛋白水解系统产生的肽类——其电荷分布、前体偏好和尺寸范围，而软组织制剂是被食用的组织，两个数据集从不同腔室描述同一物种中的同一肽类。局限性方面：实验在单一体外模型中进行；三次独立实验是较少的生物学重复；制剂未进行直接肽组成鉴定；机制解释基于转录本丰度；蛋白水平确认和屏障功能测量是后续步骤；负责活性的具体肽段尚待鉴定，按电荷和尺寸分级分离制剂并采用相同转录读出是鉴定途径；肽能否在胃肠消化中存活、是否穿越上皮并达到与实验相当的浓度需要消化模型和生物利用度研究。

结论翻译： 来自牡蛎软组织的内源性肽制剂——在不添加任何外加蛋白酶的条件下制备——改变了分化人肠上皮细胞中SRF依赖性细胞骨架基因程序的表达。该效应具有浓度依赖性，在6 h内出现，伴随编码肌动蛋白单体结合蛋白的转录本的一致性变化，且制剂的蛋白水解消化可消除该效应。在同一物种中，内源性血浆肽组学呈阴离子偏斜，47.1%的肽携带?1或更低净电荷，仅8.4%携带+2或以上，且该偏斜不受感染状态影响。因此，活性存在于内源性肽群体而非制剂中的非肽物质。负责活性的具体肽段尚待鉴定，而该肽组学中偏向阴离子的多数群体是需要直接研究的类别。基于电荷的选择仅保留该肽组学不足十分之一的群体，而搁置了构成其阴离子多数的47.1%。在该部分中鉴定活性肽并确认其在功能研究和体内研究中的效应是后续步骤。