沙棘汁中多酚的UPLC-QTOF-MS/MS定性筛查与HPLC-QqQ-MS/MS靶向定量整合分析方法开发及适用性验证

《Foods》：Development of an Integrated UPLC-QTOF-MS/MS and HPLC-QqQ-MS/MS Method for Polyphenol Analysis in Sea Buckthorn Juice

　　

研究人员开发了一种整合分析方法，将用于定性筛查的超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-QTOF-MS/MS）与用于靶向定量的高效液相色谱-三重四极杆串联质谱（HPLC-QqQ-MS/MS）相结合，用于沙棘汁中多酚的全面分析。UPLC-QTOF-MS/MS筛查获得42种候选多酚注释，并从中选取15种代表性化合物进行靶向定量，涵盖酚酸、黄烷-3-醇（flavan-3-ols）和黄酮醇。优化的HPLC-QqQ-MS/MS条件采用乙腈–0.1%甲酸水溶液作为流动相体系，以70%乙醇提取后经0.01 mol/L HCl处理，料液比为1:15（g/mL）。该定量方法的决定系数（R²）>0.99，检出限（LODs）为0.0010–0.0054 μg/g，定量限（LOQs）为0.0033–0.0179 μg/g，回收率为76.8–105.7%，相对标准偏差（RSDs）≤4.4%。所建立的方法应用于7个沙棘汁样品，15种目标多酚的总浓度范围为34.25–94.86 μg/g。7号样品（Daguo Shaji No. 7）的15种目标多酚总浓度最高，而芦丁在所有7个样品中均为定量丰度最高的化合物。该方法将高分辨率质谱筛查与经过验证的靶向定量相衔接，使目标多酚的选择能够基于实际样品的化学组成，为沙棘汁多酚谱分析和定量提供了可靠的分析途径。

研究背景与问题：沙棘（Hippophae rhamnoides L.）为胡颓子科多年生落叶植物，浆果富含维生素、有机酸、类胡萝卜素、脂肪酸、植物甾醇、多糖和多酚等。多酚主要包括酚酸、黄酮醇及其糖苷、黄烷-3-醇（flavan-3-ols）和原花青素，与涩味、苦味和氧化稳定性等感官及理化属性相关；其化学特征不仅取决于总酚/总黄酮，还取决于单个多酚的种类、浓度和相对比例，因此需对单个多酚进行可靠定性和定量。比色法易受还原糖、有机酸、维生素C等干扰且无单个化合物信息；HPLC-DAD/UV在复杂基质中共流出或异构体存在时鉴定受限；UPLC-QTOF-MS/MS适合广筛和结构注释，但常规靶向定量可能受基质影响；HPLC-QqQ-MS/MS的多反应监测（MRM）选择性和灵敏度高，但单独使用需预设目标物和标准品。Wei et al.采用LC-MS/MS分析沙棘中多种酚酸、黄酮及其糖苷；Wang et al.建立HPLC-MS/MS同时定量浆果样品中32种多酚并应用于沙棘等。基于此，研究人员以沙棘浆果制汁为基质，建立UPLC-QTOF-MS/MS定性筛查与HPLC-QqQ-MS/MS靶向定量整合方法，以实际样品化学组成指导目标多酚选择，并应用于7个大果沙棘汁样品。

关键技术方法：以新鲜沙棘浆果制得的原汁为分析基质；浆果由新疆170团丝路沙棘生物科技有限公司提供，采集于新疆塔城地区额敏县170团（46°18′46″ N，84°39′47″ E；海拔684.4 m），2025年早熟沙棘第一次采摘，设Daguo Shaji No. 1–No. 7共7个样品。采用UPLC-QTOF-MS/MS负离子全扫描、数据库匹配和碎片离子注释筛查候选多酚；选15个代表物，以HPLC-QqQ-MS/MS多反应监测（MRM）定量；样品经70%乙醇提取、0.01 mol/L HCl处理、料液比1:15（g/mL）、HLB固相萃取（SPE）净化；验证线性、检出限（LOD）、定量限（LOQ）和加标回收率。

研究结果：
3.1 定性筛查与注释（Qualitative Screening and Annotation by UPLC-QTOF-MS/MS）：负离子全扫描结合提取离子流图（EICs）、保留时间、准分子离子、质量误差和MS/MS碎片，获得42个候选多酚注释，保留时间1.34–7.75 min，质量误差?4.4–3.3 ppm（均在±5 ppm内），涵盖酚酸、黄烷-3-醇、原花青素、黄酮醇及其糖苷、单宁相关物、芪类等；从中选15个代表物用于靶向定量。
3.2.1 目标多酚选择与MRM参数优化：依据代表性、标准品可得性和MRM响应稳定性选15个（9种酚酸、3种黄烷-3-醇、3种黄酮醇及其糖苷），负离子模式下优化前体/产物离子对、碎裂电压和碰撞能，均响应稳定。
3.2.2 流动相与色谱条件优化：比较6种二元流动相，乙腈–0.1%甲酸水溶液峰形更尖锐、基线更稳定、保留时间分布更适合多组分MRM，故选为流动相。
3.2.3 样品制备条件优化：10种提取体系中，70%乙醇后0.01 mol/L HCl顺序提取总目标物30.75 μg/g，约为70%乙醇单独提取的8.9倍，检出化合物由9增至13，较70%甲醇–HCl和乙酸乙酯–HCl分别高9.45%和2.67%；料液比1:5至1:15总含量由29.68增至32.52 μg/g（增9.58%），检出由12增至13，1:20和1:25为31.95和30.77 μg/g且检出仍13，故选1:15。
3.2.4 方法验证：15个目标物R²>0.99，LOD 0.0010–0.0054 μg/g，LOQ 0.0033–0.0179 μg/g，50、100、200 μg/kg加标回收率76.8–105.7%，RSD 0.8–4.4%，准确性和重复性满足定量。
3.3 沙棘汁样品中目标多酚定量：7个样品15个目标多酚总量34.25–94.86 μg/g，顺序7>5>2>3>4>6>1，最高约为最低2.77倍；芦丁在所有样品中最高，30.05–72.10 μg/g，占总目标多酚73.72–92.96%；黄烷-3-醇呈现不同浓度模式。

讨论总结：
4.1 MS/MS碎裂特征（MS/MS Fragmentation Characteristics）：酚酸主要脱羧或侧链裂解，如没食子酸、咖啡酸、p-香豆酸[M–H]^?失去CO₂生成m/z 125、135、119；新绿原酸呈咖啡酰奎宁酸典型碎片191、179、173。黄烷-3-醇核心骨架碎裂相似，(+)-儿茶素与(?)-表儿茶素共有m/z 245、203、151、137、109，原花青素B3涉及逆Diels-Alder反应（RDA）、脱水和醌甲基化物（QM）裂解；芦丁失去芸香糖基生成槲皮素苷元m/z 301，其他黄酮醇O-糖苷生成m/z 301、315、285附近苷元离子。原儿茶酸、丁香酸、水杨酸、杨梅素未获可靠诊断碎片，质量误差<3 ppm，列为暂定注释；原儿茶酸和水杨酸后续用标准品和MRM进一步支持。
4.2 流动相优化（Mobile-Phase Optimization）：乙腈–0.1%甲酸水总体色谱性能优于其他，可能与洗脱选择性、黏度和酸度调节有关。
4.3 样品前处理条件优化（Optimization of Sample Pretreatment Conditions）：含水甲醇/乙醇优于纯醇；70%乙醇后HCl顺序提取兼顾总量和覆盖；料液比1:15后接近平台，继续增加溶剂收益有限，故选1:15。
4.4 方法应用（Application of the Established Method）：热图显示多数目标多酚在7个样品中检出；水杨酸分布较均匀，芦丁在5和7号较高；(?)-表没食子儿茶素在2号较高，(+)-儿茶素在5和7号较高，(?)-表儿茶素在2和5号较高，p-香豆酸在4号最高；新绿原酸和槲皮素仅7号检出，咖啡酸仅1和4号检出。该研究未评估抗氧化活性，提出未来可结合DPPH、ABTS、FRAP等。
4.5 方法特性与比较（Analytical Characteristics and Comparison）：分光光度法不能区分单个多酚；GC-MS对高极性非挥发性多酚覆盖有限；HPLC-DAD结构鉴定和选择性有限；靶向LC-MS/MS覆盖受预设面板限制；QTOF-MS适合广筛但常规靶向定量不如QqQ-MS/MS。本研究以QTOF筛选指导目标物选择，再用QqQ-MRM定量，较QTOF+DAD定量策略减少共流出干扰、提高选择性和可靠性。

研究结论（译）：本研究建立了整合UPLC-QTOF-MS/MS定性筛查与HPLC-QqQ-MS/MS靶向定量的分析方法，用于沙棘汁多酚分析。UPLC-QTOF-MS/MS筛查出42种候选多酚，为选择15种代表化合物进行后续靶向定量提供定性信息。优化表明，乙腈–0.1%甲酸水溶液适合作为流动相体系；70%乙醇提取后以0.01 mol/L HCl处理、料液比1:15可同时获得较高的目标分析物提取量和较宽的检测覆盖。所建立的HPLC-QqQ-MS/MS方法在验证条件下具有满意的线性、灵敏度、准确性和重复性，并成功用于7个沙棘汁样品中15种目标多酚的测定，为表征其多酚组成提供定量信息。总体而言，该整合方法将基于样品信息的高分辨率质谱筛查和结构注释与经过验证的靶向定量相衔接，为沙棘汁多酚谱分析和定量分析提供了可靠的分析途径。