《Foods》：Single-Step Extraction of Chlorella vulgaris Protein by Coupling Cell Disruption and Alkaline-Assisted Solubilization for Enhanced Recovery
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小球藻（Chlorella vulgaris, CV）是一种极具潜力的可持续蛋白质来源，然而其坚硬的细胞壁限制了蛋白质的提取效率。为应对这一挑战，研究人员此前开发了一种干法珠磨（bead milling, BM）结合碱法提取的两步工艺，使用0.1 M氢氧化钠（
小球藻（Chlorella vulgaris, CV）是一种极具潜力的可持续蛋白质来源，然而其坚硬的细胞壁限制了蛋白质的提取效率。为应对这一挑战，研究人员此前开发了一种干法珠磨（bead milling, BM）结合碱法提取的两步工艺，使用0.1 M氢氧化钠（NaOH）实现了47.3%的蛋白质增溶得率。为进一步提高蛋白质回收率、减少碱消耗并简化工艺流程，本研究开发了将细胞破碎与蛋白质增溶整合于单次操作中的单步提取策略。在所评估的方法中，单步高压均质（high-pressure homogenization, HPH）结合0.1 M NaOH工艺在两次通过（约5 min，35,000 psi）后实现了80.2%的蛋白质增溶得率，较单步BM工艺（湿法BM，1 h）和此前报道的两步工艺（2 h）分别提高了1.4倍和1.7倍。蛋白质功能特性受提取方法影响，其中单步BM提取物表现出优异的吸水能力、起泡能力和乳化性能。综上，单步HPH工艺最大化了蛋白质提取得率和工艺效率，而单步BM工艺则增强了蛋白质功能特性。这些发现推动了CV作为可持续替代蛋白质来源的高效利用。
论文解读：单步耦合细胞破碎与碱辅助增溶提取小球藻蛋白的研究
一、研究背景与问题
全球人口持续增长，预计到2050年将接近100亿，蛋白质需求随之大幅上升。传统动物性蛋白质来源（如肉类和乳制品）对土地、水资源和能源造成巨大压力，并导致温室气体排放、森林砍伐和土壤退化等问题，亟需开发可持续的替代蛋白质来源。微藻，尤其是小球藻（Chlorella vulgaris, CV），因其生长速度快、生产力高、土地需求少和淡水消耗低，成为极具潜力的可持续食用蛋白质来源。CV蛋白质含量高达48%–60%，且氨基酸组成丰富。然而，CV坚硬的细胞壁结构和胞内蛋白在水中的有限溶解性严重制约了蛋白质的高效提取。工业上常用于植物细胞透化和蛋白质增溶的温和碱液（pH最高9.5）对微藻生物质效果不佳，无法有效破坏其坚固的细胞壁结构，从而阻碍蛋白质的可及性和提取效率。
为克服上述限制，必须将有效的细胞破碎与蛋白质增溶相结合。传统微藻蛋白质提取通常采用两步顺序操作：先进行细胞破碎以破坏刚性细胞壁并释放胞内物质，再进行碱法或其他介质中的蛋白质增溶提取。研究人员此前开发的两步工艺（干法珠磨BM后碱法增溶）实现了47.3%的蛋白质增溶得率，显著高于单独碱法增溶的16.8%。然而，两步工艺耗时较长、操作复杂、设备利用率高，且多步处理增加了产品损失风险，经济吸引力不足。
二、研究目的与意义
本研究旨在通过过程强化策略，将细胞破碎与蛋白质增溶整合为单步操作，评估单步珠磨（BM）和单步高压均质（HPH）工艺的提取性能，并以此前开发的两步工艺为基准进行比较。研究的核心创新在于系统评估整合式单步处理策略是否能在蛋白质回收率、处理时间、碱消耗和蛋白质功能保持方面超越现有两步顺序工艺，从而为微藻蛋白质提取的工业化和规模化提供更高效的平台方案。
三、主要技术方法
研究采用以下关键技术方法：单步珠磨（BM）工艺，将CV生物质直接悬浮于不同浓度NaOH溶液（0–0.6 M）中进行珠磨处理（26 Hz，1 h，玻璃珠直径0.5 mm）；单步高压均质（HPH）工艺，将生物质悬浮于0.1 M NaOH中，在35,000 psi压力下进行最多5次通过处理；两步工艺作为基准，采用此前报道的干法BM结合碱法增溶数据；单独碱法增溶作为对照。蛋白质定量采用Bradford法（BSA标准曲线，R2=0.9997），固体样品蛋白质含量采用杜马斯燃烧法（Dumas，氮-蛋白转换系数6.25）。蛋白质回收通过pH诱导沉淀（pH 4.0）和冷冻干燥实现。功能特性评价包括蛋白质溶解度、吸水能力（WAC）、吸油能力（OAC）、乳化活性指数（EAI）、乳化稳定性指数（ESI）、起泡能力（FC）和泡沫稳定性（FS）。蛋白质分子量分布采用SDS-PAGE分析。所有实验均设3次独立重复，采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验进行统计分析。CV干生物质购自GO SUPERFOODS LTD（英国谢菲尔德），蛋白质含量约54.0%。
四、研究结果
4.1 单步BM工艺
单步BM在不同NaOH浓度下均显著提高了蛋白质增溶得率。使用0.1 M NaOH时，单步BM得率达58.5%，较两步工艺（47.3%）提高1.2倍，且处理时间缩短至1 h。两步工艺需使用0.7 M NaOH（7倍碱浓度）才能达到类似得率。SDS-PAGE分析显示，NaOH浓度超过0.1 M后，多个高分子量蛋白条带强度明显下降，同时约10 kDa处条带增强，提示碱性条件可能引起蛋白质片段化或结构改变。
4.2 单步HPH工艺
单步HPH在0.1 M NaOH条件下，蛋白质增溶得率随通过次数增加而上升，第二次通过时达到最大值80.2%。继续增加通过次数导致得率逐渐下降，可能与过度处理引起的蛋白质变性和聚集有关。单步HPH得率分别是单步BM（58.5%）和两步BM（47.3%）的1.4倍和1.7倍，而单独碱法增溶仅达15.2%。该得率也显著高于文献报道的CV湿法BM（39.0%–54.0%）和HPH辅助提取（51.68%–58.0%）的结果。
4.3 蛋白质回收与纯度
不同方法所得提取物蛋白质纯度相近（66%–68%），但蛋白质回收率差异显著：单步HPH最高（78.5%），其次为单步BM（43.6%）、两步BM（36.1%）和单独碱处理（7.0%）。结果表明提取方法对蛋白质释放和回收的影响远大于对最终纯度的影响。
4.4 功能特性
蛋白质溶解度普遍较低，单步HPH提取物溶解度显著低于BM类提取物。单步BM提取物的WAC最高，单步HPH最低；单步HPH提取物的OAC最高。起泡能力方面，单步BM最高，单步HPH最低，而泡沫稳定性不受提取方法显著影响。乳化性能差异最为显著：单步BM的EAI最高（74.3 m2 g?1），其次为两步BM（65.8 m2 g?1），单步HPH最低（47.6 m2 g?1）；单步BM的ESI最高（17.5 min），两步BM和单步HPH分别为11.1和12.6 min。
五、讨论与结论
研究表明，不同提取方法各有优势，不存在适用于所有场景的通用最优方案。单步BM提取物具有优异的乳化活性和稳定性，适合需要增强乳化功能的应用；单步HPH则实现最高蛋白质回收率，适合以最大化回收为优先目标的应用。提取方法的选择应综合考虑回收效率和功能特性保持之间的权衡。
需要指出的是，提取物蛋白质含量约66%–68%，含有大量共提取的非蛋白组分（可能包括碳水化合物、脂质、色素和矿物质等），这些组分可能对观察到的功能特性有所贡献，因此功能特性应视为蛋白质富集提取物的整体属性。此外，研究中观察到的蛋白质增溶、回收、分子量分布和功能特性差异背后的机制尚未直接验证，相关解释应视为待进一步实验证实的假设。
本研究结论表明，将BM或HPH与碱处理整合为单步工艺，通过同时实现细胞破碎和蛋白质增溶，显著提升了微藻蛋白质提取效率。单步HPH在0.1 M NaOH条件下实现了最高蛋白质回收率（78.5%），蛋白质纯度（66.3%）与单步BM和两步工艺相当。两种单步工艺均降低了碱消耗。该单步机械化学提取工艺的核心创新在于将细胞破碎与蛋白质增溶整合为单一操作步骤，实现了更高的蛋白质回收率、更短的处理时间和更低的工艺复杂度，展现出作为工业微藻蛋白质生产过程强化策略的巨大潜力。未来研究应聚焦于阐明不同提取方法引起功能特性差异的结构基础，并评价这些蛋白质富集提取物的营养品质（包括氨基酸组成和体外蛋白质消化率）以及在食品体系中的感官特性和应用表现，以支持其作为可持续替代蛋白质配料的工业化应用。
